Amplite 过氧化物和过氧化酶近红外荧光底物

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产品优势  

1.在 pH 4–10 范围内荧光信号稳定，克服传统底物（如 Amplex Red™ 在低 pH 下信号骤降）的局限性。

2.相比二氢荧光素（如 DCFH）等底物，Amplite® IR 的空气氧化效应极低，减少假阳性信号。

 

适用范围

用于检测 H₂O₂ 和 过氧化物酶活性。

 

产品介绍

Amplite® IR 是一种荧光型过氧化物酶底物，在与过氧化物酶和 H₂O₂ 反应时会产生近红外荧光，适用于检测 H₂O₂ 和 过氧化物酶活性。该底物反应产物的最大吸收波长为 647 nm，最大发射波长为 670 nm。由于生物样本在 600 nm 以上 波长范围内极少发生自吸收或自发荧光，Amplite® IR 的近红外吸收/荧光特性可显著降低检测背景干扰。

与其他 HRP 底物（如二氢荧光素、二氢罗丹明）不同，Amplite® IR 的空气氧化效应极低。相较于 Amplex Red™，其荧光信号在 pH 4-10 范围内保持稳定，且具有优异的水溶性。在需要低 pH 条件的检测中（Amplex Red™ 荧光会显著减弱），Amplite® IR 是更理想的选择。

我们已成功将 Amplite® IR 应用于多种免疫检测中的 HRP 活性测定。该底物还可用于痕量 H₂O₂ 检测。由于 H₂O₂ 是许多酶促氧化还原反应的产物，Amplite® IR 可通过偶联酶反应检测多种氧化酶及其相关酶/底物或辅因子（如葡萄糖、乙酰胆碱、胆固醇、L-谷氨酸、氨基酸等）的活性。

 

适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	640nm
Em：	680nm
cutoff:	650nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

样品实验方案

简要概述

1.在磷酸盐缓冲液中制备含 100 µM Amplite® IR 和 0.8 U/mL 过氧化物酶 的工作液，每孔加入 50 µL。

2.加入 50 µL H₂O₂ 标准品或待测样本。

3.在室温下孵育0-30分钟

4.使用荧光酶标仪检测 Ex/Em = 640/680 nm 处的荧光强度。

重要提示：
本方案适用于溶液或活细胞中的 H₂O₂ 检测，实际操作需根据实验需求调整。

 

储备溶液制备

所有未使用的储备液应分装后 -20°C 保存，避免反复冻融。

Amplite® IR 储备液

用无水 DMSO 溶解 Amplite® IR 粉末，配制成 10-25 mM 的储存液。

 

Amplite® IR工作溶液（2X）：

用 50 mM 磷酸盐缓冲液（或其他适用缓冲液）稀释储备液，配制成 100-200 µM 的工作液（终浓度 50-100 µM/孔）。

每孔加入 50 µL（384 孔板每孔加 25 µL）。

注意事项：

1.Amplite® IR 遇硫醇类物质（如 DTT、β-巯基乙醇）不稳定，终浓度 >10 µM 会显著降低检测动态范围。

2.NADH 和还原型谷胱甘肽（GSH）可能干扰实验结果。

3.建议每次实验使用新鲜配制的储备液。

 

操作步骤  

上清液H₂O₂检测步骤

1.向含有H₂O₂标准品、空白对照和测试样品的各孔中分别加入50 µL 2X Amplite® IR工作液，使每孔总体积达到100 µL。

注：对于384孔板，每孔加入25 µL样品和25 µL 2X Amplite® IR工作液。

2.室温避光孵育0-30分钟。

3.使用荧光酶标仪在Ex/Em = 640/680 nm波长下监测荧光强度变化。

注：Amplite® IR过氧化物酶底物容易发生自氧化，因此应在加入H₂O₂反应混合液后立即读取荧光值以提高信噪比。

4.数据处理：

仅含检测缓冲液的空白孔荧光值作为对照，需从含H₂O₂的各孔测定值中扣除。

 

细胞H₂O₂释放检测步骤

1.按储备溶液方法配制Amplite® IR工作液，但需用细胞培养系统所用培养基替代磷酸盐缓冲液。推荐培养基包括：

a) Krebs-Ringers磷酸盐缓冲液（KRPB）

b) Hanks平衡盐溶液（HBSS）

c) 无血清培养基

2.将细胞接种于96孔板（每孔50-100 µL），按实验需求激活细胞。

注：需设置阴性对照（单独培养基和未激活细胞）用于测定背景荧光。

3.向各细胞孔和H₂O₂对照孔中加入50 µL H₂O₂反应混合液。

注：对于384孔板，每孔加入25 µL细胞悬液和25 µL H₂O₂反应混合液。

4.室温避光孵育0-30分钟。

5.使用荧光酶标仪在Ex/Em = 640/680 nm波长下监测荧光强度变化。

备选方案：可将反应液转移至白色透明底微孔板，在670 nm波长下用吸光度酶标仪检测（灵敏度低于荧光检测法）。

注意事项：荧光背景会随时间增加，因此必须对各时间点的数据扣除空白孔荧光值