Amplite 荧光法胞内辣根过氧化物酶检测试剂盒 绿色荧光

货号11503存储条件f/l
规格200 Tests价格3096
Ex (nm)498Em (nm)517
分子量溶剂
产品详细介绍


简要概述

        Amplite 荧光法胞内辣根过氧化物酶检测试剂盒 绿色荧光 是美国AAT Bioquest生产的用于检测过氧化物的试剂盒,过氧化氢(H2O2)是一种活性氧代谢副产物,可作为许多氧化应激相关状态的关键调节剂。它涉及许多与哮喘,动脉粥样硬化,糖尿病血管病变,骨质疏松症,一些神经退行性疾病和唐氏综合症有关的生物学事件。也许H2O2生物学最有趣的方面是最近的报告,即抗体具有将分子氧转化为过氧化氢的能力,有助于免疫系统的正常识别和破坏过程。测量这种活性物质将有助于确定氧化应激如何调节各种细胞内途径。

        这种Amplite 荧光过氧化氢测定试剂盒使用我们的非荧光Amplite 绿色过氧化物酶底物来量化溶液和细胞提取物中的过氧化氢。它还可用于通过酶偶联反应检测多种氧化酶活性。该试剂盒是一种优化的“混合和读数”分析,与HTS液体处理仪器兼容。它提供灵敏的一步荧光测定法,可在100μL测定体积(30 nM,图1)中检测少至3皮摩尔的H2O2。该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行,并且易于适应自动化。 其信号可通过Ex / Em = ~540 / 590 nm的荧光酶标仪或~570 nm的吸光度酶标仪轻松读取。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的Amplite 荧光法过氧化氢检测试剂盒。 

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产品说明书

96孔板的测定方案

概述

准备H2O2反应混合物(50μL)

加入H2O2标准品或测试样品(50μL)

在室温下孵育10-30分钟在Ex / Em = 540/590 nm处监测荧光强度

注意:在开始实验之前,在室温下解冻所有试剂盒组分。

 

操作方法

1.准备库存解决方案:

1.1100X Amplite 红色过氧化物酶底物原液:将250μLDMSO(组分E)加入到Amplite 红色底物(组分A)的小瓶中。 应及时使用原液; 任何剩余的溶液应等分并在-20℃重新冷冻。

注意:避免反复冻融循环并避免光照。

1.220U / mL过氧化物酶储备溶液:将1mL测定缓冲液(组分C)加入到辣根过氧化物酶(组分D)的小瓶中。

注意:未使用的HRP溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20 ℃。

1.320mM H2O2储备溶液:将22.7L的3%H2O2(0.88M,组分B)加入977L的测定缓冲液(组分C)中。

注意:稀释的H2O2溶液不稳定。 应丢弃未使用的部分。

 

2.准备H2O2反应混合物:

 

3.准备H2O2标准品(0至10μM)的连续稀释液:

注意1:在存硫醇如DTT和β-巯基乙醇的情况下,组分A不稳定。 高于10M(最终浓度)的硫醇将显着降低测定动态范围。

注意2:NADH和谷胱甘肽(还原形式:GSH)可能会干扰检测。

3.1将1μL20mM H2O2溶液(来自步骤1.3)加入1999μL测定缓冲液(组分C)中,得到10μMH2O2标准品。

3.2取200μL10μMH2O2标准品进行1:3连续稀释,得到3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μMH2O2标准品系列稀释液。

3.3如说明书中表2和3中所述,将H2O2标准品和含H2O2的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中。

 

4.在上清液反应中进行H2O2测定:

4.1将50μLH2O2反应混合物(来自步骤2)加入到H2O2标准品,空白对照和测试样品的每个孔中(参见步骤3.3),使总H2O2测定体积为100μL/孔。

注意:对于384孔板,每孔加入25μL样品和25μLH2O2反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15至30分钟,避光。

4.3在Ex / Em = 540±10/590±10nm(最佳Ex / Em = 540 / 590nm)下用荧光板读数器监测荧光增加。

注意:也可以将板的内容物转移到白色透明底板上,并用吸光度酶标仪在576±5nm的波长下读数。与荧光读数相比,吸收检测具有较低的灵敏度。

 

5.对细胞进行H2O2检测:

Amplite 荧光过氧化氢检测试剂盒可用于测量细胞中H2O2的释放。 以下是建议的协议,可以进行修改以满足特定的研究需求。

5.1 H2O2反应混合物应按步骤2制备,但分析缓冲液(组分C)应替换为细胞培养系统中使用的培养基。建议的培养基包括(a)Krebs Ringers磷酸盐缓冲液(KRPB);(b)汉克斯平衡盐溶液(HBSS); 或(c)无血清培养基。

5.2在96孔板(50-100μL/孔)中制备细胞,并根据需要激活细胞。

注意:包括阴性对照(单独培养基和非活化细胞)用于测量背景荧光。

5.3将50μLH2O2反应混合物(来自步骤5.1)加入到细胞和H2O2标准品的每个孔中(来自步骤3.3)

5.4在室温下孵育反应15至30分钟,避光。

5.5用Ex / Em = 540±10/590±10nm(最佳Ex / Em = 540 / 590nm)的荧光板读数器监测荧光增加。

 

参考文献

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Dopamine-mediated oxidation of methionine 127 in α-synuclein causes cytotoxicity and oligomerization of α-synuclein
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Hydrogen peroxide stimulates the epithelial sodium channel through a phosphatidylinositide 3-kinase-dependent pathway
Authors: He-Ping Ma
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说明书
Amplite 荧光法胞内辣根过氧化物酶检测试剂盒 绿色荧光.pdf