Amplite NAD+/NADH检测试剂盒(比色法)
货号15258存储条件F/L
规格400 Tests价格3540
Ex (nm)575Em (nm)
分子量溶剂
产品详细介绍


简要概述

        Amplite NAD+/NADH检测试剂盒(比色法)是AAT Bioquest研发的检测NAD+/NADH的试剂盒。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式,NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP,通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代谢生物反应,例如脂肪酸和核酸合成,其需要NADPH作为还原剂。 在叶绿体中,NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。 通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。

        传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定通过监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化来进行。 Amplite™荧光总NAD和NADH检测试剂盒为敏感检测NAD和NADH提供了一种便捷的方法。 系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NAD / NADH,其显着提高了检测灵敏度。 此外,该测定具有非常低的背景,因为其在红色可见范围内运行,这显着降低了生物样品引起的干扰。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的Amplite NAD+/NADH检测试剂盒。 

Amplite™比色NAD / NADH检测试剂盒提供灵敏的一步法检测,可在100μL检测体积(300 nM;图1)中检测少至30皮摩尔的NAD(H)。 可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行测定。 其信号可通过吸光度酶标仪在~575nm或~570nm至~605nm的吸光度比下轻松读取,以提高测定灵敏度。



产品说明书

96孔板测定示例

 

概述

准备NAD / NADH反应混合物(50μL)

添加NADH标准品或测试样品(50μL)

在室温下孵育15分钟--2小时

监测Ex / Em = 540 / 590nm处的荧光强度

 

操作方法

1.准备NADH储备溶液:

将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品(组分C)的小瓶中,得到1mM(1nmol / L)NADH储备溶液。

注意:未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.准备NAD / NADH反应混合物:

将10mL NAD / NADH传感器缓冲液(组分B)加入NAD / NADH再循环酶混合物(组分A)的瓶中,并充分混合。

注意:NAD / NADH反应混合物足以用于两个96孔板。 未使用的NAD / NADH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

3.准备NADH标准品的系列稀释液(0至10μM):

3.1将10μL的NADH储备溶液(来自步骤1)加入到990L PBS缓冲液(pH 7.4)中,以产生10μM(10pmol / L)NADH标准溶液。

注意:稀释的NADH标准溶液不稳定,应在4小时内使用。

3.2取200μL10μMNADH标准溶液进行1:3连续稀释,得到NADH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM连续稀释液。

3.3如表1和2中所述,将含有NADH标准品和含NAD / NADH的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中。

注意:根据需要准备细胞或组织样本。

 

表1实心黑色96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

BL

BL

TS

TS

NS1

NS1

….

….

NS2

NS2

 

 

NS3

NS3

 

 

NS4

NS4

 

 

NS5

NS5

 

 

NS6

NS6

 

 

NS7

NS7

 

 

注意:NS = NADH标准,BL =空白对照,TS =测试样品。

 

表2.每个孔的试剂组成

NADH Standard

Blank Control

Test Sample

Serial Dilutions*: 50 μL

PBS: 50 μL

50 μL 

注意:将连续稀释的NADH标准品(0.01μM至10μM)加入NS1至NS7的孔中,一式两份。 高浓度的NADH(例如,>100μM,最终浓度)可能由于NADH传感器(对非荧光产物)的过度氧化而导致荧光信号降低。

 

4.在上清液反应中运行NAD / NADH测定:

4.1将50μL的NADH反应混合物(来自步骤2)加入NADH标准品,空白对照和测试样品(来自步骤3.3)的每个孔中,使得总NADH测定体积为100μL/孔。

注意:对于384孔板,每孔加入25μL样品和25μLNADH反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时,避光。

4.3用Ex / Em = 540 / 590nm的荧光板读数器监测荧光增加。

注1:也可将板的内容物转移到白色透明底板上,用吸光度酶标仪在576±5nm波长下读数。 与荧光读数相比,吸收检测具有较低的灵敏度。

注意2:对于NAD / NADH比率测量,建议使用试剂盒15263。

注意3:对于基于细胞的NAD / NADH测量,建议使用ReadiUse™哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *(目录号20012)裂解细胞。

 

数据分析

        空白孔中的荧光(仅用PBS缓冲液)用作对照,并从具有NADH反应的那些孔的值中减去。 NADH标准曲线如图1所示。

注意:荧光背景随时间增加,因此减去每个数据点的空白孔的荧光强度值是很重要的。

图1.使用NOVOStar酶标仪(BMG Labtech),在固体黑色96孔板中用Amplite™总NAD和NADH测定试剂盒测量NADH剂量反应。 在孵育1小时(n = 3)时可以检测到低至100nM(10pmol /孔)的NADH,而NADPH没有响应。

 

参考文献

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说明书
Amplite NAD+/NADH检测试剂盒(比色法).pdf