Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(比色法)

货号15260存储条件 在零下15度以下保存, 避免光照
规格400 Tests价格3840
Ex (nm)575Em (nm)
分子量溶剂
产品详细介绍


简要概述

Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(比色法)是AAT Bioquest研发的检测NADP+/NADPH的试剂盒,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是细胞中发现的两种重要的辅因子。NADH是NAD +的还原形式,NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP,通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。NADP用于合成代谢生物反应,例如脂肪酸和核酸合成,其需要NADPH作为还原剂。在叶绿体中,NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定通过监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化来完成。该方法具有低灵敏度和高干扰,因为该测定在需要昂贵的石英微孔板的UV范围内进行。

Amplite™比色总NADP和NADPH检测试剂盒为敏感检测NADP和NADPH提供了一种便捷的方法。 系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NADP / NADPH,其显着提高了检测灵敏度。 此外,该测定具有非常低的背景,因为其在较长波长范围内运行,这显著降低了来自生物样品的干扰。 该实验证明了高灵敏度和低干扰。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒。

Amplite™比色总NADP和NADPH分析试剂盒提供灵敏的一步法分析,可在100μL分析体积(100 nM)内检测少至10皮摩尔的NADP(H)。 该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行,并且容易适应自动化而无需分离步骤。 其信号可通过吸光度酶标仪在~575nm或~570nm至~605nm的吸光度比下轻松读取,以提高测定灵敏度。 如果需要更高的灵敏度,建议使用Cat#15259或15264。

 

适用仪器


光吸收酶标仪  
吸收: 576 ± 5 nm
推荐孔板: 透明底板
荧光酶标仪  
激发: 540nm
发射: 590nm
cutoff: 570nm
推荐孔板: 黑色孔板


产品说明书

96孔板测定示例

概述

准备NADP / NADPH反应混合物(50μL)

加入NADPH标准品或测试样品(50μL)

在室温下孵育15分钟--2小时

监测575±5nm处的吸光度强度

注意:在开始实验之前,在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

 

操作方法

1.准备NADPH原液:

将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品(组分C)的小瓶中,得到1mM(1nmol / L)NADPH储备溶液。

注意:未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.制备NADP / NADPH反应混合物:

将10mL NADP / NADPH传感器缓冲液(组分B)加入NADP / NADPH再循环酶混合物(组分A)的瓶中,并充分混合。

注意:这种NADP / NADPH反应混合物足以用于两个96孔板。 未使用的NADP / NADPH混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

3.准备NADPH标准品的连续稀释液(0至10μM):

3.1将10μLNADPH储备溶液(来自步骤1)加入990L PBS缓冲液中以产生10M(10pmol / L)NADPH标准溶液。

注意:稀释的NADPH标准溶液不稳定,应在4小时内使用。

3.2取200μL10μMNADPH标准溶液进行1:3连续稀释,得到NADPH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01,0.003和0μM连续稀释液。

3.3如表1和表2所述,将NADPH标准品和含有NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微孔板中

注意:根据需要准备细胞或组织样本。

 

表1在白色/透明底96孔微孔板中的NADPH标准品和测试样品的布局

BL

BL

TS

TS

NS1

NS1

….

….

NS2

NS2

 

 

NS3

NS3

 

 

NS4

NS4

 

 

NS5

NS5

 

 

NS6

NS6

 

 

NS7

NS7

 

 

注意:NS = NADPH标准,BL =空白对照,TS =测试样品。

 

表2.每个孔的试剂组成

NADPH Standard

Blank Control

Test Sample

Serial Dilutions*: 50 μL

PBS: 50 μL

50 μL 

注意:将连续稀释的NADPH标准品从0.003μM至3μM加入NS1至NS7的孔中,一式两份。 高浓度的NADPH(例如,>100μM,最终浓度)可能由于NADPH传感器的过度氧化而导致信号降低。

 

4.在上清液中运行NADP / NADPH测定:

4.1将50μLNADPH反应混合物(来自步骤2)加入NADPH标准品,空白对照和测试样品的每个孔中(参见步骤3.3),使总NADPH测定体积为100μL/孔。

注意:对于384孔板,每孔加入25μL样品和25μLNADPH反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时,避光。

4.3用吸光度读数仪在575±5 nm或~570 nm至~605 nm的吸光度比下观察吸光度的增加,以提高检测灵敏度。

注意1:对于NADP / NADPH比率测量,建议使用试剂盒15263。

注意2:对于基于细胞的NADP / NADPH测量,建议使用ReadiUse™哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *(Cat#20012)裂解细胞。

 

数据分析

        空白孔中的吸光度(仅用PBS缓冲液)用作对照,并从NADPH反应孔的值中减去。 NADPH标准曲线如图1所示。

        注意:吸光度背景随时间增加,因此减去每个数据点的空白孔的吸光度非常重要。

图1.使用NOVOStar酶标仪(BMG Labtech),在白色/透明底96孔板中用Amplite™比色总NADP和NADPH测定试剂盒测量NADPH剂量反应。 在孵育1小时(n = 3)时可以检测到低至100nM(10pmol /孔)的NADPH,而NADH没有响应。

 

参考文献

Comparative transcriptome analysis of a long-time span two-step culture process reveals a potential mechanism for astaxanthin and biomass hyper-accumulation in Haematococcus pluvialis JNU35
Authors: Luodong Huang, Baoyan Gao, Manman Wu, Feifei Wang, Chengwu Zhang
Journal: Biotechnology for Biofuels (2019): 18

Celastrol attenuates angiotensin II mediated human umbilical vein endothelial cells damage through activation of Nrf2/ERK1/2/Nox2 signal pathway
Authors: Miao Li, Xin Liu, Yongpeng He, Qingyin Zheng, Min Wang, Yu Wu, Yuanpeng Zhang, Chaoyun Wang
Journal: European Journal of Pharmacology (2017): 124--133

Cytosolic Redox Status of Wine Yeast (Saccharomyces Cerevisiae) under Hyperosmotic Stress during Icewine Fermentation
Authors: Fei Yang, Caitlin Heit, Debra L Inglis
Journal: Fermentation (2017): 61

Epigenetic regulation of Runx2 transcription and osteoblast differentiation by nicotinamide phosphoribosyltransferase
Authors: Min Ling, Peixin Huang, Shamima Islam, Daniel P Heruth, Xuanan Li, Li Qin Zhang, Ding-You Li, Zhaohui Hu, Shui Qing Ye
Journal: Cell & Bioscience (2017): 27

MCU-dependent mitochondrial Ca2+ inhibits NAD+/SIRT3/SOD2 pathway to promote ROS production and metastasis of HCC cells
Authors: T Ren, H Zhang, J Wang, J Zhu, M Jin, Y Wu, X Guo, L Ji, Q Huang, H Yang
Journal: Oncogene (2017)

Metabolic and molecular insights into an essential role of nicotinamide phosphoribosyltransferase
Authors: Li Q Zhang, Leon Van Haandel, Min Xiong, Peixin Huang, Daniel P Heruth, Charlie Bi, Roger Gaedigk, Xun Jiang, Ding-You Li, Gerald Wyckoff
Journal: Cell Death & Disease (2017): e2705

Pyrroloquinoline Quinone, a Redox-active o-Quinone, Stimulates Mitochondrial Biogenesis by Activating SIRT1/PGC-1α Signaling Pathway
Authors: Kazuhiro Saihara, Ryosuke Kamikubo, Kazuto Ikemoto, Koji Uchida, Mitsugu Akagawa
Journal: Biochemistry (2017)

Resveratrol attenuates excessive ethanol exposure induced insulin resistance in rats via improving NAD+/NADH ratio
Authors: Gang Luo, Bingqing Huang, Xiang Qiu, Lin Xiao, Ning Wang, Qin Gao, Wei Yang, Liping Hao
Journal: Molecular Nutrition & Food Research (2017)

A Snapshot of the Plant Glycated Proteome STRUCTURAL, FUNCTIONAL, AND MECHANISTIC ASPECTS
Authors: Tatiana Bilova, Elena Lukasheva, Dominic Brauch, Uta Greifenhagen, Gagan Paudel, Elena Tarakhovskaya, Nadezhda Frolova, Juliane Mittasch, Gerd Ulrich Balcke, Alain Tissier
Journal: Journal of Biological Chemistry (2016): 7621--7636

AMPK activation protects cells from oxidative stress-induced senescence via autophagic flux restoration and intracellular NAD+ elevation
Authors: Xiaojuan Han, Haoran Tai, Xiaobo Wang, Zhe Wang, Jiao Zhou, Xiawei Wei, Yi Ding, Hui Gong, Chunfen Mo, Jie Zhang
Journal: Aging cell (2016): 416--427

 

相关产品

产品名称 货号
Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(比色法)增强灵敏度 Cat#15276
Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(荧光法) 红色荧光 Cat#15259
Amplite NADPH检测试剂盒(比色法) Cat#15272


说明书
Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(比色法).pdf