Amplite NADH检测试剂盒(荧光法) 红色荧光
货号15261存储条件F/L
规格400 Tests价格3540
Ex (nm)571Em (nm)585
分子量溶剂
产品详细介绍


简要概述

        Amplite NADH检测试剂盒(荧光法)是美国AAT Bioquest 研发的检测NADH的试剂盒,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式,NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP,通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。
        传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定通过监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化来完成。 传统NAD / NADH和NADP / NADPH测定的短UV波长使得这些方法具有低灵敏度和高干扰。 由于NAD和NADH的吸收较弱,紫外吸收方法需要较大的样品量,如果样品的可用性有限,则使相同的NAD和NADH测量不实用。

        这种Amplite 荧光NADH检测试剂盒为检测NADH提供了一种便捷的方法。 系统中的酶在酶循环反应中特异性识别NADH。 此外,该测定具有非常低的背景,因为其在红色可见范围内运行,这显著降低了生物样品的干扰。 Amplite 荧光NADH分析试剂盒提供灵敏的一步法分析,可在100μL分析体积(1μM)内检测少至100皮摩尔的NADH。 可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行测定。 其信号可通过Ex / Em = 540/590 nm的荧光酶标仪或~576 nm的吸光度酶标仪轻松读取。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的Amplite NADH检测试剂盒。 



产品说明书

96孔板测定示例

概述

准备NADH反应混合物(50μL)

加入NADH标准品或测试样品(50μL)

在室温下孵育15分钟 -  2小时

监测Ex / Em = 540/590 nm处的荧光强度

 

1.准备NADH储备溶液:
将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品(组分C)的小瓶中以制备1mM(1nmol / L)NADH储备溶液。
注意:未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.准备NADH反应混合物:
将10mL Amplite NADH测定缓冲液(组分B)加入NADH再循环酶混合物(组分A)的瓶中,并充分混合。
注意:这种NADH反应混合物足以用于两个96孔或四个384孔板。未使用的NADH反应混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

3.准备NADH标准品的系列稀释液(0至100μM):
3.1将50μL的NADH储备溶液(来自步骤1)加入到450μLPBS缓冲液(pH 7.4)中以产生100μM(100pmol / L)NADH标准溶液。
注意:稀释的NADH标准溶液不稳定,应在4小时内使用。

3.2取200μL的100μMNADH标准溶液进行1:3连续稀释,得到30,1,10,3,1,0.3,0.1和0μM的NADH标准品系列稀释液。

3.3如表1和表2所述,将NADH标准品和含有NADH的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中
注意:根据需要准备细胞或组织样本。

 

表1实心黑色96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

BL

BL

TS

TS

NS1

NS1

….

….

NS2

NS2

 

 

NS3

NS3

 

 

NS4

NS4

 

 

NS5

NS5

 

 

NS6

NS6

 

 

NS7

NS7

 

 

注意:NS = NADH标准,BL =空白对照,TS =测试样品

 

表2每个孔的试剂组成

NADH Standard

Blank Control

Test Sample

Serial Dilutions*: 50 μL

PBS: 50 μL

50 μL 

*注意:将连续稀释的NADH标准品(0.1μM至100μM)加入NS1至NS7的孔中,一式两份

 

4.在上清液反应中运行NADH测定:
4.1将50μL的NADH反应混合物(来自步骤2)加入NADH标准品,空白对照和测试样品的每个孔中(参见步骤3.3),使总NADH测定体积为100μL/孔
注意:对于384孔板,每孔加入25μL样品和25μLNADH反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时,避光。
4.3用Ex / Em = 530-570 / 590-600nm的荧光板读数器监测荧光增加(在Ex / Em = 540 / 590nm处最佳)。
注1:也可将板的内容物转移到白色透明底板上,用吸光度酶标仪在576±5nm波长下读数。 与荧光读数相比,吸收检测具有较低的灵敏度。
注2:对于基于细胞的NADH测量,建议使用ReadiUse 哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *(cat#20012)裂解细胞。

 

数据分析

        空白孔中的荧光(仅用PBS缓冲液)用作对照,并从具有NADH反应的那些孔的值中减去。 NADH标准曲线如图1所示。
        注意:荧光背景随时间增加,因此减去每个数据点的空白孔的荧光强度值是很重要的。

图1.使用NOVOStar酶标仪(BMG Labtech)在96孔黑色板中用Amplite NADH测定试剂盒测量NADH剂量反应。 在孵育1小时(n = 3)时,可以检测到低至1μM(100pmol /孔)的NADH,而NAD没有响应。

 

参考文献

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说明书
Amplite NADH检测试剂盒(荧光法) 红色荧光.pdf