Amplite NADPH检测试剂盒(荧光法) 红色荧光

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规格400 Tests价格3840
Ex (nm)571Em (nm)585
分子量溶剂
产品详细介绍


简要概述

Amplite NADPH检测试剂盒(荧光法) 红色荧光是美国AAT Bioquest研发的检测NADPH的试剂盒,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式,NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP,通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代谢生物反应,例如脂肪酸和核酸合成,其需要NADPH作为还原剂。 在叶绿体中,NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。 通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。 传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定通过监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化来完成。 该方法具有低灵敏度和高干扰,因为该测定在需要昂贵的石英微孔板的UV范围内进行。

这种Amplite 荧光NADPH检测试剂盒为检测NADPH提供了一种便捷的方法。 系统中的酶特异性识别酶再循环反应中的NADPH。 此外,该测定具有非常低的背景,因为其在红色可见范围内运行,这显着降低了来自生物样品的干扰。

Amplite 荧光NADPH检测试剂盒提供灵敏的一步法检测,在100μL检测体积(1μM;图1)中检测少至100皮摩尔的NADPH。 该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行,并且易于适应自动化。 其信号可通过Ex / Em = 540/590 nm的荧光酶标仪或~576 nm的吸光度酶标仪轻松读取。 该测定试剂盒已用于筛选使用NADP / NADPH作为辅因子的酶活性。 它还被用于在基于细胞的测定中灵敏检测NADPH。 与其他商业试剂盒相比,该试验具有更高的信号/背景比。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的NADPH检测试剂盒。 

 

适用仪器


荧光酶标仪  
激发: 540nm
发射 590nm
推荐孔板: 黑色孔板


产品说明书

96孔板测定示例

概述

准备NADPH反应混合物(50μL)

加入NADPH标准品或测试样品(50μL)

在室温下孵育15分钟 -  2小时在Ex / Em = 540/590 nm处

监测荧光增加

注意:在开始实验之前,在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

 

操作方法

1.准备NADPH原液:

将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品(组分C)的小瓶中以制备1mM(1nmol / L)NADPH储备溶液。

注意:未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

 

2.准备NADPH反应混合物:

将10mL Amplite™NADPH测定缓冲液(组分B)加入NADPH回收酶混合物(组分A)的瓶中,并充分混合。

注意:这种NADPH反应混合物足以用于两个96孔板。 未使用的NADPH反应混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

 

3.准备NADPH标准品的连续稀释液(0至100μM):

3.1将50μLNADPH储备液(来自步骤1)加入450μLPBS缓冲液(pH 7.4)中,得到100μM(100pmol / L)NADPH标准溶液。

注意:稀释的NADPH标准溶液不稳定,应在4小时内使用。

3.2取200μL100μMNADPH标准溶液,进行1:3连续稀释,得到30,10,3,1,0.3,0.1和0μM的NADPH标准品系列稀释液。

3.3如表1和2中所述,将NADPH标准品和含有NADPH的测试样品的系列稀释液加入到实心黑色96孔微量培养板中。

注意:根据需要准备细胞或组织样本。

 

表1实心黑色96孔微孔板中NADPH标准品和测试样品的布局

BL

BL

TS

TS

NS1

NS1

….

….

NS2

NS2

 

 

NS3

NS3

 

 

NS4

NS4

 

 

NS5

NS5

 

 

NS6

NS6

 

 

NS7

NS7

 

 

注意:NS = NADPH标准,BL =空白对照,TS =测试样品

 

表2每个孔的试剂组成

NADPH Standard

Blank Control

Test Sample

Serial Dilutions*: 50 μL

PBS: 50 μL

50 μL 

*注意:将连续稀释的NADPH标准品(0.1μM至100μM)加入NS1至NS7的孔中,一式两份

 

4.在上清液反应中运行NADPH测定:

4.1将50μLNADPH反应混合物(来自步骤2)加入NADPH标准品,空白对照和测试样品的每个孔中(参见步骤3.3),使总NADPH测定体积为100μL/孔。

注意:对于384孔板,每孔加入25μL样品和25μLNADPH反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时,避光。

4.3在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm((最佳Ex / Em = 540 / 590nm)下用荧光板读数器监测荧光增加。

注意1:平板的内容物也可以转移到白色透明底板上,用吸光度酶标仪在576±5nm波长下读数。 与荧光读数相比,吸收检测具有较低的灵敏度。

注意2:对于基于细胞的NADPH测量,建议使用ReadiUse™哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *(cat#20012)裂解细胞。

 

数据分析

        空白孔中的荧光(仅用PBS缓冲液)用作对照,并从具有NADPH反应的那些孔的值中减去。 NADPH标准曲线如图1所示。

        注意:荧光背景随时间增加,因此减去每个数据点的空白孔的荧光强度值是很重要的。

图1.使用NOVOStar酶标仪(BMG Labtech),在96孔黑色板中用Amplite 荧光NADPH测定试剂盒测量NADPH剂量反应。 低至1μM(100pmol /孔)可以在孵育1小时(n = 3)时检测到NADPH,而NADP没有响应。

 

参考文献

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说明书
Amplite NADPH检测试剂盒(荧光法) 红色荧光.pdf