Amplite NAD/NADH比率检测试剂盒(比色法)
货号15273存储条件F/L
规格250 Tests价格4140
Ex (nm)460Em (nm)
分子量溶剂
产品详细介绍


简要概述

        Amplite NAD/NADH比率检测试剂盒(比色法)是美国AAT Bioquest研发的检测NAD/NADH的试剂盒,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)是细胞中发现的两种重要的辅酶。 NAD形成NADP,通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADH(NADPH)是NAD(NADP)的还原形式,NAD(NADP)是NADH(NADPH)的氧化形式。 NAD或NADP在氧化还原反应中起辅助因子的作用,在细胞反应中转移电子。 氧化形式和还原形式之间的平衡是NAD / NADH(NADP / NADPH)比率。 该比率是指示细胞氧化还原状态的重要组分,并且它是反映代谢活性和细胞健康的测量。 在健康的哺乳动物组织中,游离NAD +和NADH之间的比率的估计可以高达700.相反,NADP / NADPH比率通常为约0.005,因此NADPH是该辅酶的主要形式。

        该Amplite 比色NAD / NADH比率分析试剂盒提供了一种比色法,用于测量培养细胞中细胞内总NAD / NADH量和NAD / NADH比率。 在该测定中,裂解物中的NAD可以用NAD提取溶液提取并通过酶反应转化为NADH,然后通过NADH探针识别,在反应后得到黄色染料,其在460nm处具有吸光度。 产生的染料量与细胞裂解物中NAD或NADH的浓度成正比,可用作细胞NAD / NADH浓度的指示剂。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的NAD/NADH检测试剂盒。 



产品说明书

96孔板检测示例

 

概述

准备25μLNADH标准品和/或测试样品在室温下

加入25μLNAD提取液孵育15分钟

加入25μL中和溶液加入75μLNAD/ NADH反应混合物在

室温下孵育15分钟至2小时

监测 在460nm处的吸光度

注意:在开始实验之前,在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

 

操作步骤

1.准备NADH储备溶液:

将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品(组分C)的小瓶中,得到1mM(1nmol / L)NADH储备溶液。

注意:未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

 

2.准备NAD / NADH反应混合物:

2.1将8 mL NADH探针缓冲液(组分B-II)加入到NAD / NADH回收酶混合物(组分A)的瓶中,并充分混合。

2.2将2 mL NADH探针(组分B-I)加入上述瓶中(来自步骤2.1)并充分混合。

注意:这种NAD / NADH反应混合物足以进行125~200次分析。 未使用的NAD / NADH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

 

3.准备连续稀释的NADH标准品(0至10μM):

3.1将10μL1mMNADH储备溶液(来自步骤1)加入990L PBS缓冲液(pH7.4)中,得到10μM(10pmol / L)NADH标准溶液。

注意:稀释的NADH标准溶液不稳定,应在4小时内使用。

3.2取200μL10M NADH标准溶液(来自步骤3.1)进行1:2连续稀释,得到5,2.5,1.25,0.625,0.313,0.156,0.078和0 M系列稀释的NADH标准品。

 

4.运行总NAD / NADH分析(总共400个分析/试剂盒):

4.1如表1和2中所述,将含有NADH标准品和含NAD / NADH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微孔板中。

注意:根据需要准备细胞或组织样本NAD / NADH裂解缓冲液(组分G)可用于裂解细胞(详见附录)。

 

表1.白色/透明底96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

BL

BL

TS

TS

NS1

NS1

….

….

NS2

NS2

 

 

NS3

NS3

 

 

NS4

NS4

 

 

NS5

NS5

 

 

NS6

NS6

 

 

NS7

NS7

 

 

注意:NS = NADH标准,BL =空白对照,TS =测试样品

 

表2.每个孔的试剂组成

NADH Standard

Blank Control

Test Sample

Serial Dilutions*: 50 μL

PBS: 50 μL

50 μL 

*注意:将连续稀释的NADH标准品(0.078μM至5μM)加入NS1至NS7的孔中,一式两份。 高浓度的NADH(例如,>100μM,最终浓度)将导致饱和信号并使校准曲线非线性。

 

4.2将50μLNAD/ NADH反应混合物(来自步骤2.2)加入NADH标准品,空白对照和测试样品(来自步骤4.1)的每个孔中,以使总NAD / NADH测定体积为100μL/孔。

4.3在室温下孵育反应15分钟至2小时,避光。

4.4使用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。

 

5.运行NAD / NADH比率分析(总共250个分析/试剂盒):

5.1如表3和4中所述,将连续稀释的NADH标准品和/或含NAD / NADH的测试样品加入白色/透明96孔微孔板中。

注意:根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见,裂解缓冲液(组分G)可用于裂解细胞(详见附录)。

 

表3.白色/透明96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

BL

BL

TS

TS

TS (NAD)

TS (NAD)

NS1

NS1

….

….

….

….

NS2

NS2

 

 

 

 

NS3

NS3

 

 

 

 

NS4

NS4

 

 

 

 

NS5

NS5

 

 

 

 

NS6

NS6

 

 

 

 

NS7

NS7

 

 

 

 

注意:NS = NAD / NADH标准; BL =空白对照; TS =测试样品; TS(NAD)=用NAD提取溶液(组分D)处理10至15分钟的测试样品,然后用中和溶液(组分E)中和。

 

表4.每个孔的试剂组合物

NADH Standard

Blank Control

Test Sample (NAD/NADH)

Test Sample (NAD Extract)

Serial Dilutions*: 25 μL

PBS: 25 μL

Test Sample: 25 μL

Test Sample: 25 μL

Component F: 25 μL

Component F: 25 μL

Component F: 25 μL

Component D: 25 μL

Incubate at room temperature for 10 to 15 minutes

Component F: 25 μL

Component F: 25 μL

Component F: 25 μL

Component E: 25 μL

Total: 75 μL

Total: 75 μL

Total: 75 μL

Total: 75 μL

*注意:将连续稀释的NADH标准品(0.078μM至5μM)加入NS1至NS7的孔中,一式两份。 高浓度的NADH(例如,>100μM,最终浓度)将导致饱和信号并使校准曲线非线性。

 

5.2对于NAD提取(NAD量):将25μLNAD提取溶液(组分D)加入含有NAD / NADH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟,然后加入25μLNADH中和溶液(组分E)以中和NAD提取物,如表3和4中所述。

对于总NAD和NADH(总量):将25μLNAD/ NADH对照溶液(组分F)加入NADH标准品和含有NAD / NADH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟,然后如表3和4中所述添加25μL提取对照溶液(组分F)。

注意:根据需要准备细胞或组织样本。裂解缓冲液(组分G)可用于裂解细胞(详见附录)。

5.3将75μL的NADH反应混合物(来自步骤2.2)加入NADH标准品,空白对照和测试样品(NAD / NADH和NAD提取物)(来自步骤5.1)的每个孔中,使总NADH测定体积为150μL /好。

5.4在室温下孵育反应15分钟至2小时,避光。

5.5使用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。

 

数据分析

        空白孔(仅PBS缓冲液)中的吸光度用作对照,并从具有NADH反应的那些孔的值中减去。

图1. Amplite™比色NAD / NADH比率分析试剂盒用于使用SpectraMax酶标仪(Molecular devices)测量白色/透明96孔微孔板中的总NAD / NADH量和NAD / NADH比率。

A-总NADH和NAD剂量反应:孵育1小时可检测到低至0.1μM的总NADH。

B-NAD / NADH比:在有或没有NAD提取溶液的情况下处理等量的NAD和NADH混合物15分钟,然后在室温下用提取溶液中和。 在460nm读取信号。 基于图1B中所示的吸光度计算NAD / NADH摩尔比。

 

附录:使用组分D(裂解缓冲液)的测试样品制剂

1.植物细胞样品:用200mg / mL的裂解缓冲液均质化,并以2500rpm离心5-10分钟,使用上清液进行测试。

2.细菌细胞样品:离心收集细菌细胞((10,000 g,0°C,15 min)。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液,将处理后的溶液在室温下保持15分钟.2500℃离心 转速5分钟,并用上清液进行试验。

3.哺乳动物细胞样品:从平板孔中取出培养基,每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液(或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔),并将处理过的溶液保持在室温下 15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟,使用上清液进行测试。

4.组织样品:称取约20mg组织,用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟,使用上清液进行测定。

 

参考文献

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Cytosolic Redox Status of Wine Yeast (Saccharomyces Cerevisiae) under Hyperosmotic Stress during Icewine Fermentation
Authors: Fei Yang, Caitlin Heit, Debra L Inglis
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说明书
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