Amplite NAD/NADH比率检测试剂盒(比色法)
| Ex (nm) | - | Em (nm) | - |
| 分子量 | - | 溶剂 | - |
| 存储条件 | 在零下15度以下保存, 避免光照 |
产品货期
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产品优势
1.灵敏度高，在100 μL检测体系中可检测低至3 μM的NADH
2.兼容96孔或384孔微孔板形式
适用范围
用于NAD/NADH比率检测
产品介绍
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）是细胞中两种重要的辅因子。NADH是NAD+的还原形式，而NAD+是NADH的氧化形式。NADP是在腺苷核苷酸2'位通过酯键连接磷酸基团后形成的。NADP主要用于合成代谢反应（如脂肪酸和核酸合成），这些反应需要还原剂NADPH的参与。传统的NAD/NADH和NADP/NADPH检测方法是通过监测340 nm处NADH或NADPH的吸光度来实现的。该方法存在灵敏度低、干扰性强的缺点，因为检测需要在紫外波段进行，且必须使用昂贵的石英微孔板。
Amplite® NAD/NADH比率检测试剂盒提供了一种灵敏便捷的NAD、NADH及其比率检测方案。该试剂盒中的NADH探针是一种显色传感器，经NADH还原后可在~460 nm处产生最大吸光度。~460 nm处吸光度的增加量与溶液中NADH浓度成正比。该NADH探针无需酶参与反应即可识别NADH，信号可通过吸光酶标仪在~460 nm处直接读取。Amplite®比色法NADH检测试剂盒灵敏度高，在100 μL检测体系中可检测低至3 μM的NADH。本检测可采用便捷的96孔或384孔微孔板形式进行操作。
适用仪器
| 吸光度酶标仪 | |
| 吸光度: | 460 nm |
| 推荐孔板: | 透明底板 |
细胞样品制备
关于细胞样本制备的指导原则，请访问：
https://www.aatbio.com/resources/guides/cell-samplepreparation.html
储备液配制
除非另有说明，所有未使用的储备液在配制后均应分装成单次使用量，并于-20°C保存。避免反复冻融。
NADH 标准品溶液 (1 mM)向 NADH 标准品（组分 C）瓶中加入 200 µL 1X PBS 缓冲液，配制成 1 mM (1 nmol/µL) 的 NADH 标准品溶液。
标准品溶液配制
为方便操作，可使用连续稀释规划工具：
https://www.aatbio.com/tools/serial-dilution/15273
NADH 标准品
取 50 µL 的 1 mM (1 nmol/µL) NADH 标准品溶液，加入 450 µL 1X PBS 缓冲液 (pH 7.4)，生成 100 µM (100 pmols/µL) NADH 标准品溶液。然后取 100 µM NADH 标准品溶液，用 1X PBS 缓冲液进行 1:2 的连续稀释，获得系列稀释的 NADH 标准品 (NS1 - NS7)。
注：稀释后的 NADH 标准品溶液不稳定，应在 4 小时内使用。
工作液配制
向 NAD/NADH 循环酶混合物（组分 A）瓶中加入 8 mL NADH 探针缓冲液（组分 B-II），混匀。
将 2 mL NADH 探针（组分 B-I）加入含组分 A+B-II 的瓶中，充分混匀，配制成 NAD/NADH 工作液。
注：此 NAD/NADH 工作液可进行 125-200 次检测。工作液稳定性较差，请随配随用并注意避光。
注：也可尝试使用适量超纯水（如 500 µL）溶解组分 A 后，再按比例与 B-II 和 B-I 混合配制适量 NAD/NADH 工作液。
样本实验方案
总 NAD+/NADH 检测（试剂盒规格：400 次检测/盒）：
表 1. 白色/透明底 96 孔微孔板中 NADH 标准品与测试样本的布局。
NS = NADH 标准品 (NS1 - NS7, 100 至 1.56 µM)
BL = 空白对照
TS = 测试样本
| BL | BL | TS | TS |
| NS1 | NS1 | ... | ... |
| NS2 | NS2 | ... | ... |
| NS3 | NS3 | ||
| NS4 | NS4 | ||
| NS5 | NS5 | ||
| NS6 | NS6 | ||
| NS7 | NS7 |
表 2. 各孔试剂组成。高浓度 NADH（例如，>100 µM，终浓度）会导致信号饱和并使标准曲线非线性。
| 孔位 | 体积 | 试剂 |
|---|---|---|
| NS1 - NS7 | 50 µL | 系列稀释液 (100 至 1.56 µM) |
| BL | 50 µL | 1X PBS |
| TS | 50 µL | 测试样本 |
1.根据表 1 和表 2 提供的布局，制备 NADH 标准品 (NS)、空白对照 (BL) 和测试样本 (TS)。
注： 按需制备细胞或组织样本。为方便起见，可使用裂解缓冲液（组分 G）裂解细胞，将细胞与裂解缓冲液在 37°C 下孵育 15 分钟，并使用上清液进行实验。
2.向 NADH 标准品、空白对照和测试样本的每个孔中加入 50 µL NAD/NADH 工作液，使总 NAD/NADH 检测体积为 100 µL/孔。
3.将反应体系在室温下避光孵育 15 分钟至 2 小时。
4.使用酶标仪在 460 nm 处监测吸光度的增加。
NAD/NADH 比率检测（试剂盒规格：250 次检测/盒）：
表 3. 白色/透明底 96 孔微孔板中 NADH 标准品与测试样本的布局。
NS = NADH 标准品 (NS1 - NS7, 100 至 1.56 µM)；
BL = 空白对照；
TS = 测试样本；
TS (NAD) = 用 NAD 提取溶液（组分 D）处理 10 至 15 分钟，然后用中和溶液（组分 E）中和的测试样本。
| BL | BL | TS | TS | TS (NAD) | TS (NAD) |
| NS1 | NS1 | ... | ... | ||
| NS2 | NS2 | ... | ... | ||
| NS3 | NS3 | ||||
| NS4 | NS4 | ||||
| NS5 | NS5 | ||||
| NS6 | NS6 | ||||
| NS7 | NS7 |
表 4. 各孔试剂组成。高浓度 NADH（例如，>100 µM，终浓度）会导致信号饱和并使标准曲线非线性。
| 试剂/步骤 | NADH 标准品 | 空白对照 | 测试样本 (NAD+NADH) | 测试样本 (NAD 提取物) |
|---|---|---|---|---|
| 起始 | 系列稀释液: 25 µL | 1X PBS: 25 µL | 测试样本: 25 µL | 测试样本: 25 µL |
| 第一步添加试剂 | 组分 F: 25 µL | 组分 F: 25 µL | 组分 F: 25 µL | 组分 D: 25 µL |
| 第一步孵育 | 37°C 孵育 10-15 分钟 | 37°C 孵育 10-15 分钟 | 37°C 孵育 10-15 分钟 | 37°C 孵育 10-15 分钟 |
| 第二步添加试剂 | 组分 F: 25 µL | 组分 F: 25 µL | 组分 F: 25 µL | 组分 E: 25 µL |
| 总体积 | 75 µL | 75 µL | 75 µL | 75 µL |
各孔组成请参考表 3 和表 4。
对于 NAD 提取（NAD 含量）： 向含有测试样本的 NAD/NADH 孔中加入 25 µL NAD 提取溶液（组分 D）。在 37°C 下孵育 10 至 15 分钟，然后加入 25 µL 中和溶液（组分 E）以中和 NAD 提取物，如表 3 和表 4 所述。
对于总 NAD 和 NADH（总量）： 向 NADH 标准品和含有 NAD/NADH 的测试样本孔中加入 25 µL 提取对照溶液（组分 F）。在 37°C 下孵育 10 至 15 分钟，然后加入 25 µL 提取对照溶液（组分 F），如表 3 和表 4 所述。
注： 按需制备细胞或组织样本。为方便起见，可使用裂解缓冲液（组分 G）裂解细胞。
向 NADH 标准品、空白对照、测试样本 (NAD/NADH) 和测试样本 (NAD 提取物) 的每个孔中加入 75 µL NAD/NADH 工作液，使总检测体积为 150 µL/孔。
将反应体系在室温下避光孵育 15 分钟至 2 小时（我们在所示图中测试了 60 分钟）。
使用酶标仪在 460 nm 处监测吸光度的增加。
试剂应用文献
