Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(比色法)增强灵敏度

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规格400 Tests价格3840
Ex (nm)460Em (nm)
分子量溶剂
产品详细介绍


简要概述

Amplite 总NADP和NADPH检测试剂盒 (比色法)增强灵敏度是美国AAT Bioquest研发的检测总NADP和NADPH的试剂盒,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式。 NAD形成NADP,通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定基于监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化。 NAD / NADH和NADP / NADPH测定的短紫外波长使得传统方法具有低灵敏度和高干扰。 AAT Bioquest的Amplite™比色总NADP / NADPH检测试剂盒为检测总NADP和NADPH提供了一种便捷的方法。系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NADP / NADPH。无需从样品混合物中纯化NADP / NADPH。酶循环反应显着提高了检测灵敏度。 NADPH探针是一种生色传感器,在NADP减少时具有460nm的最大吸光度。 NADPH探针的吸收与溶液中NADPH的浓度成正比。 Amplite™比色总NADP和NADPH分析试剂盒提供灵敏的分析,可在100μL分析体积中检测低至0.03μM的总NADP / NADPH。与试剂盒#15260相比,该试剂盒具有更高的灵敏度。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的总NADP和NADPH检测试剂盒。 

 

适用仪器


光吸收酶标仪  
吸收: 460nm
推荐孔板: 透明底板


产品说明书

96孔板检测示例

概述

准备NADP / NADPH反应混合物(50μL)

加入NADPH标准品或测试样品(50μL)

在室温下孵育15分钟至2小时

监测460nm处的吸光度

注意:在开始实验之前,在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

 

操作步骤

1.准备NADPH原液:

将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品(组分C)的小瓶中以制备1mM(1nmol / L)NADPH储备溶液。

注意:未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

 

2.制备NADP / NADPH反应混合物:

2.1将8mL NADPH探针缓冲液(组分B-II)加入到NADP / NADPH回收酶混合物(组分A)的瓶中,并充分混合。

2.2将2 mL NADPH探针(组分B-I)加入上述瓶中(来自步骤2.1)并充分混合。

注意:这种NADP / NADPH反应混合物足以进行200次分析。未使用的NADP / NADPH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

 

3.准备NADPH标准品的连续稀释液(0至2μM):

3.1将2L 1mM NADPH储备溶液(来自步骤1)加入998L PBS缓冲液(pH7.4)中,产生2M(2 pmols / L)NADPH标准溶液。

注意:稀释的NADPH标准溶液不稳定,应在4小时内使用。

3.2取200μL2MNADPH标准溶液(来自步骤3.1)进行1:2连续稀释,得到1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0313和0M系列稀释的NADPH标准品。

3.3如表1和2中所述,将含有NADPH标准品和含NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微量培养板中。

注意:根据需要准备细胞或组织样本。为方便起见,裂解缓冲液(组分D)可用于裂解细胞。 (详见附录)。 

 

表1:白色/透明底96孔微孔板中NADPH标准品和测试样品的布局

BL

BL

TS

TS

NS1

NS1

….

….

NS2

NS2

 

 

NS3

NS3

 

 

NS4

NS4

 

 

NS5

NS5

 

 

NS6

NS6

 

 

NS7

NS7

 

 

注意:NS = NADPH标准,BL =空白对照,TS =测试样品

 

表2:每个孔的试剂组成

NADPH Standard

Blank Control

Test Sample

Serial Dilutions*: 50 μL

PBS: 50 μL

50 μL 

*注意:将连续稀释的NADPH标准品(0.0313μM至2μM)加入NS1至NS7的孔中,一式两份。 高浓度的NADPH(例如,>30μM,最终浓度)将导致饱和信号并使校准曲线非线性。

 

4.在上清液反应中运行NADPH测定:

4.1将50μL的NADP / NADPH反应混合物(来自步骤2.2)加入NADPH标准品,空白对照和测试样品的每个孔中(参见步骤3.3),使总NADP / NADPH测定体积为100μL/孔

注意1:对于384孔板,每孔加入25μL样品和25μLNADP/ NADPH反应混合物。

注意2:根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见,裂解缓冲液(组分D)可用于裂解细胞。 (详见附录)。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时,避光。

4.3用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。

 

数据分析

        空白孔中的吸光度(仅PBS缓冲液)用作对照,并从具有NADPH反应的那些孔的值中减去。

图1 使用SpectraMax酶标仪(Molecular devices),在96孔白色/透明底板中用Amplite ™比色总NADP和NADPH测定试剂盒*增强灵敏度*测量NADPH剂量反应。孵育1小时(n = 3)可以检测到低至0.03μM的NADPH,在460nm处测量吸光度。

 

附录:使用组分G(NAD / NADH裂解缓冲液)的测试样品制剂

 

1.植物细胞样品:用200mg / mL的裂解缓冲液均质化,并以2500rpm离心5-10分钟,使用上清液进行测试。

2.细菌细胞样品:离心收集细菌细胞((10,000 g,℃,15 min)。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液,将处理后的溶液在室温下保持15分钟.2500℃离心 转速5分钟,并用上清液进行试验。

3.哺乳动物细胞样品:从平板孔中取出培养基,每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液(或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔),并将处理过的溶液保持在室温下 15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟,使用上清液进行测试。

4.组织样品:称取约20mg组织,用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟,使用上清液进行测定。

 

参考文献

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说明书
Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(比色法)增强灵敏度.pdf