Cell Meter 活细胞Caspase 1结合检测试剂盒 绿色荧光

货号20108存储条件f/l
规格25 Tests价格3720
Ex (nm)493Em (nm)517
分子量溶剂
产品详细介绍


简要概述

        我们的Cell Meter 活细胞半胱天冬酶活性检测试剂盒基于半胱天冬酶的荧光抑制剂。这些抑制剂具有细胞渗透性和非细胞毒性。一旦进入细胞,半胱天冬酶抑制剂与活性半胱天冬酶共价结合。 Caspase-1主要参与促炎细胞因子的激活和细胞凋亡过程。已经证明胱天蛋白酶1对肽序列Tyr-Val-Ala-Asp(YVAD)具有底物选择性。该试剂盒使用FAM-YVAD-FMK作为半胱天冬酶1活性的荧光指示剂。 FAM-YVAD-FMK在凋亡细胞中不可逆地结合活化的半胱天冬酶1。一旦与半胱天冬酶1结合,荧光试剂保留在细胞内。结合抑制胱天蛋白酶1但不会阻止细胞凋亡的进行。

        有多种参数可用于监测细胞凋亡。这种Cell Meter 活细胞半胱天冬酶1活性检测试剂盒旨在通过测量活细胞中的caspase 1活化来检测细胞凋亡。它用于定量凋亡细胞中活化的半胱天冬酶1活性,或用于筛选半胱天冬酶1抑制剂。绿色标记试剂FAM-YVAD-FMK允许通过荧光显微镜,流式细胞仪或荧光酶标仪直接检测凋亡细胞中活化的半胱天冬酶1。该试剂盒为所有必需组分提供优化的分析方案。

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产品说明书

分离细胞的检测方案

概述

用密度为5×105到2×106个细胞/ mL的测试化合物制备细胞

将FAM-YVAD-FMK以1:150的比例加入到细胞溶液中

在室温下孵育1小时

将细胞沉淀,用缓冲液或生长培养基洗涤并重悬细胞

在Ex / Em = 490 / 525nm处分析细胞

注:使用前将所有部件在室温下解冻。

 

操作方法

1.根据您的特异性诱导方案,将细胞培养至最适于细胞凋亡诱导的密度,但不超过2 x 106个细胞/ mL。同时,对于每种标记条件,以与诱导群体相同的密度培养非诱导的阴性对照细胞群。以下是一些诱导悬浮培养细胞凋亡的例子:

1)用2μg/ ml喜树碱处理Jurkat细胞3小时。

2)用1μM星形孢菌素处理Jurkat细胞3小时。

3)用4μg/ ml喜树碱处理HL-60细胞4小时。

4)用1μM星形孢菌素处理HL-60细胞4小时。

注意:应对每个细胞系进行单独评估,以确定诱导细胞凋亡的最佳细胞密度。

2.通过向FAM-YVAD-FMK(组分A)的小瓶中加入50μLDMSO制备150X FAM-YVAD-FMK DMSO储备溶液。

3.将150×FAM-YVAD-FMK DMSO储备溶液(来自步骤1)以1:150的比例添加到细胞溶液中,并将细胞在37℃,5%CO 2培养箱中孵育1小时。

注1:对于FAM-YVAD-FMK标记,细胞可以浓缩至~5×10 6个细胞/ mL。 未使用的150X FAM-YVAD-FMK DMSO储备溶液应分为单次使用的等分试样并储存在-20°C。

注2:对于粘附细胞,用0.5mM EDTA轻轻提起细胞以保持细胞完整,并在用FAM-YVAD-FMK孵育之前用含血清的培养基洗涤细胞一次。

注3:适当的孵育时间取决于所用的细胞类型和细胞浓度。 优化每个实验的孵育时间。

4.将细胞以约200g旋转5分钟,并用1mL洗涤缓冲液(组分B)洗涤细胞两次。 将细胞重悬于所需量的洗涤缓冲液中。

注1:FAM-YVAD-FMK是荧光的,因此清除任何未结合的试剂以消除背景非常重要。

注2:对于分离的细胞,应将细胞浓度调节至每个微量滴定板孔中2-5×10 5个细胞/100μL等分试样,用于步骤6。

5.如果需要,用DNA染色标记细胞(如用于死细胞的碘化丙锭,或用于细胞核染色的整个群体的Hoechst)。

6.通过荧光显微镜,流式细胞仪或荧光酶标仪在Ex / Em = 490 / 525nm处检测荧光强度(对于碘化丙锭,Ex / Em = 535/635 nm;对于Hoechst染料,Ex / Em = 350 / 461纳米)。

6.1对于流式细胞仪,使用FL1通道监测荧光强度(FL2通道用于碘化丙锭染色)。

6.2用于荧光显微镜和荧光酶标仪。将100μL细胞悬浮液置于96孔黑壁/微量滴定板透明底部的每个孔中。

注意:如果需要平衡细胞浓度,调整诱导细胞的悬浮体积以接近非诱导细胞群的细胞密度。如果您的细胞治疗不会导致受刺激细胞群数量的显着损失,则此调整步骤是可选的。

6.3使用FITC通道在荧光显微镜下观察细胞(用于碘化丙啶染色的TRITC通道,用于Hoechst染色的DAPI通道)。

6.4使用荧光酶标仪,使用Ex / Em = 490 / 525nm(在515nm处截止)底部读取模式监测荧光强度。

 

参考文献

Helicobacter pylori Secreted Protein HP1286 Triggers Apoptosis in Macrophages via TNF-Independent and ERK MAPK-Dependent Pathways
Authors: Raquel Tavares, Sushil Kumar Pathak
Journal: Frontiers in Cellular and Infection Microbiology (2017): 58

Death receptor 3 mediates necroptotic cell death
Authors: Sebastian Bittner, Gertrud Knoll, Martin Ehrenschwender
Journal: Cellular and Molecular Life Sciences (2016): 1--12

Helicobacter pylori protein JHP0290 exhibits proliferative and anti-apoptotic effects in gastric epithelial cells
Authors: Raquel Tavares, Sushil Kumar Pathak
Journal: PloS one (2015): e0124407

 

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说明书
Cell Meter 活细胞Caspase 1结合检测试剂盒 绿色荧光 .pdf