钙离子荧光探针Fluo4AM *Ultrapure Grade* *CAS 273221-67-3*

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产品优势  

Fluo-4-4 AM（超纯级） 是一种高纯度、细胞膜渗透性的钙离子荧光探针，其绿色荧光在检测活细胞钙瞬变时（通过显微镜或流式细胞术）可提供卓越的信噪比。

1.高亲和力钙离子指示剂： 解离常数Kd = 345 nM；与钙离子结合后，荧光强度增强超过100倍。

2.单波长检测： 激发/发射波长 = 495/528 nm，兼容标准FITC光学滤片。

3.优化的细胞加载： 改进的AM酯配方，能更有效地将探针递送至细胞质。

4.BAPTA基螯合剂： 具有快速的钙离子结合动力学特性，适用于实时检测钙瞬变信号。

适用范围

用于钙离子检测

产品介绍

1.产品背景

Fluo-4 AM 是一种细胞膜渗透性的绿色荧光钙探针，用于荧光显微镜检查和流式细胞术。是早期钙离子探针 Fluo-3 的结构类似物，其中的氯原子被氟原子所取代。这一变化导致其吸收光谱发生约 12 nm 的蓝移，从而产生 495 nm 的激发峰。这一点很重要，因为它使得 Fluo-4 能被 488 nm 的氩激光更有效地激发，产生更亮的荧光信号。因此，检测所需的染料量更少，从而降低了实验中的细胞毒性。

2.使用方法

Fluo-4 AM 的分子量为 1096.95 道尔顿。其钙结合亲和力为 345 nM。可通过将 Fluo-4 AM 溶解在 DMSO 中（2 至 5 mM）来制备储备溶液。为将其加载到细胞中，需用缓冲液（例如含有 0.04% Pluronic® F-127 的 HHBS）稀释储备液，制备成浓度为 2 至 20 µM 的工作液。

3.激发/发射光谱

Fluo-4 是一种荧光化合物，其激发峰位于 495 nm，发射峰位于 528 nm。

4.作用机制

钙离子感应：Fluo-4 有两个重要的功能亚基：一个基于 BAPTA 的离子载体和一个基于荧光素的荧光团。当未与钙结合时，BAPTA 核心会通过光诱导电子转移 淬灭探针的荧光团部分，从而使 Fluo-4 不发出荧光。一旦与 Ca²⁺ 结合，PeT 效应减弱，使得荧光团亚基能够发出荧光，导致荧光强度增强超过 100 倍。

细胞膜渗透性：其细胞膜渗透性是通过在 Fluo-4 上连接一个乙酰氧甲基酯 基团来实现的。这增加了其疏水性，使其能够轻易穿透活细胞的完整细胞膜。一旦进入细胞，细胞内无处不在的非特异性酯酶会切割 AM 酯基团。这一点很重要，因为 AM 酯基团会淬灭荧光。因此，只有在具有活性酶的活细胞中的钙离子才能被检测到

细胞内滞留：位于细胞膜中的有机阴离子转运蛋白会导致 Fluo-4 从细胞中排出，造成染料滞留性差和背景荧光增加。一种解决方案是使用抑制剂，如丙磺舒。或者，可以使用具有更好细胞滞留性的探针，例如 Cal-520 AM。

5.应用

Fluo-4 AM 可用于在各种仪器平台（如荧光显微镜、流式细胞术、荧光光谱学和荧光微孔板检测仪）上研究细胞内游离钙离子浓度。鉴于 GPCR 作为治疗靶点的重要性，Fluo-4 在高通量筛选和药物发现应用中也具有重要意义

溶液配制

除特别说明外，所有未使用的储备液均应分装为单次用量，配制后保存于-20°C环境，并避免反复冻融

Fluo-4 AM储备溶液

使用高质量无水DMSO制备2至5 mM 的Fluo-4 AM储备溶液。

工作溶液配制

Fluo-4 AM工作溶液

1.实验当天，将Fluo-4AM溶解在DMSO中，或将储备溶液的等分试样解冻至室温。

2.选用合适的缓冲液（如Hanks-Hepes缓冲液）配制2-20 μM工作液，并添加0.04% Pluronic® F-127表面活性剂。针对多数细胞系，推荐4-5 μM终浓度，具体加载浓度需通过实验优化。

注：Pluronic F-127用于提高Fluo-4 AM的水溶性。可从百萤购买各种Pluronic F-127溶液。
注：若细胞存在有机阴离子转运体，建议在工作液中添加1-2 mM丙磺舒（孔内终浓度0.5-1 mM）以防止水解产物外排。多种形式的丙磺舒产品，包括水溶性、钠盐和稳定溶液，可从百萤购买。

操作步骤

以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。本方案仅提供指南，实际应根据您的具体需求进行修改。

1.在生长培养基中培养细胞过夜。

2.次日，将1X Fluo-4 AM工作溶液添加到孔板中。

注意：如果你的化合物干扰血清，在染色前用新鲜的HHBS缓冲液代替生长培养基。

3.将加入染料的孔板在37°C的细胞培养箱中培养30至60分钟。

注：将染料培养2小时以上可以提高某些细胞系的信号强度。

4.用含阴离子转运抑制剂（如1 mM丙磺舒）或者HHBS缓冲液代替染料工作溶液，去除多余的探针。

5.使用FITC滤光片荧光显微镜（激发/发射490/525 nm，Cutoff515 nm）或配备液体分配系统的酶标仪（如FDSS/FLIPR/FlexStation）进行实时荧光检测

试剂应用文献