钙离子荧光探针Cal-520, 钾盐
货号21141存储条件F/L
规格1 mg价格4740
Ex (nm)492Em (nm)514
分子量921.08溶剂Water
产品详细介绍


简要概述

        Cal-520 ,Cal-590 和Cal-630 提供最强大的均匀荧光测定工具,用于检测细胞内钙动员。它们是荧光钙敏感染料,与现有的钙指示剂(如Fluo-3 AM,Fluo-4 AM和Rhod-2 AM)相比,具有显着改善的信噪比和细胞内保留。表达通过钙发出信号的GPCR或钙通道的细胞可以预装载可以穿过细胞膜的Cal-520 AM,Cal-590 AM或Cal-630 AM。一旦进入细胞内,Cal 520 AM,Cal-590 AM或Cal-630 AM的亲脂性阻断基团被细胞内酯酶切割,产生带负电荷的荧光染料,留在细胞内。它们与钙结合后的荧光大大增强。当用激动剂刺激细胞时,该受体表示细胞内钙的释放,这显着增加了Cal-520 ,Cal-590 或Cal-630 的荧光。高灵敏度和> 100倍荧光增强的特性使Cal-520 AM,Cal-590 AM或Cal-630 AM成为测量细胞钙的理想指标。高信噪比和更好的细胞内保留使Cal-520 ,Cal-590 或Cal-630 钙测定成为评估GPCR和钙通道靶标以及筛选其激动剂和拮抗剂的有力工具。

        除了方便的激发波长和钙的大荧光增强外,Cal-520 ,Cal-590 和Cal-630 主要定位于细胞溶胶中,不像Rhod-2主要位于线粒体中。 此外,Cal-590 和Cal-630 的长Ex / Em波长使这些染料成为完美的钙指示剂,与绿色荧光蛋白(GFP)细胞系的多色检测兼容。 此外,Cal-520 ,Cal-590 或Cal-630 钙测定经过优化,可与大多数现有荧光仪器兼容。 Cal-520在488 nm处可以很好地激发,并与FITC滤光片组一起使用。 Cal-590经过优化,可在555 nm激发,并与TRITC / Cy3滤光片组配合使用。 Cal-590经过优化,可在594 nm激发,并与TexasRed®滤光片组配合使用。光谱和钙结合特性总结如下(参见说明书中的表1)。

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产品说明书

使用Cal-520 AM,Cal-570 AM或Cal-630 AM酯类

1.使用Cal-520 ,Cal-590 或Cal-630 AM酯:

        AM酯是非极性酯,其易于穿过活细胞膜,并且通过活细胞内的细胞酯酶快速水解。AM酯广泛用于非侵入性地将各种极性荧光探针装载到活细胞中。但是,使用AM酯时必须小心,因为它们易于水解,特别是在溶液中。它们应在使用前重新配制成高质量的无水二甲基亚砜(DMSO)。DMSO储备溶液可以在-20℃下干燥储存并避光。在这些条件下,AM酯应稳定数月。以下是我们推荐的将Cal-520 AM,Cal-590 AM或Cal-630 AM酯加入活细胞的方案。该方案仅提供指南,实际应根据您的具体需求进行修改。

a)在高质量无水DMSO中制备2至5 mM Cal-520 AM,Cal-590 AM或Cal-630 AM酯的储备溶液。

b)在实验当天,将Cal-520 AM,Cal-590 AM或Cal-630 AM溶解在DMSO中或将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。在Hanks和Hepes缓冲液(HHBS)或您选择的缓冲液(0.04%Pluronic®F-127)中制备10至20μM的染料工作溶液。细胞加载所需指示剂的确切浓度必须凭经验确定。

注意:非离子型洗涤剂Pluronic®F-127有时用于增加Cal-520 AM,Cal-590 AM或Cal-630 AM酯的水溶性。

c)如果您的细胞(如CHO细胞)含有有机阴离子转运蛋白,可将丙磺舒(1-2 mM)加入染料工作溶液中(最终浓度为0.5-1 mM)以减少渗漏去酯化指标。

d)将等体积的染料工作溶液(来自步骤b或c)加入细胞板中。

e)将染料加载板在细胞培养箱中孵育60至90分钟,然后在室温下将板孵育另外30分钟。

注意:孵育染料超过2小时可以为某些细胞系提供更好的信号强度。

f)用HHBS或您选择的缓冲液(含有阴离子转运蛋白抑制剂,如1mM丙磺舒,如果适用)替换染料工作溶液,以去除多余的探针。

g)在Ex / Em = 490 / 525nm(对于Cal-520 AM),540 / 5000nm(对于Cal-590 AM)或600 / 640nm(对于Cal-630 AM)进行实验。

 

2.测量细胞内钙响应:

为了确定溶液的游离钙浓度或单波长钙指示剂的Kd,使用以下等式:

[Ca]free = Kd[F ─ Fmin]/Fmax ─ F]

其中F是实验钙水平下指示剂的荧光,Fmin是不存在钙时的荧光,Fmax是钙饱和探针的荧光。

        解离常数(Kd)是探针对钙的亲和力的量度。 与校准溶液相比,荧光指示剂的Ca结合和光谱性质在细胞环境中变化非常显着。 细胞内指标的原位反应校准通常产生显着高于体外测定的Kd值。 通过在离子载体如A-23187,4-溴A-23187和离子霉素存在下将加载的细胞暴露于受控的Ca2+缓冲液来进行原位校准。 或者,细胞透化剂如洋地黄皂苷或X-100可用于将指示剂暴露于细胞外培养基的受控Ca2+水平。

 

参考文献

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说明书
钙离子荧光探针Cal-520, 钾盐.pdf