Cell Meter™固定细胞和组织TUNEL细胞凋亡测定试剂盒*深红色荧光*

货号22855存储条件 在零下15度以下保存, 避免光照
规格25 Tests价格4884
Ex (nm)649Em (nm)664
分子量溶剂
产品详细介绍


简要概述

Cell Meter TUNEL细胞凋亡测定试剂盒是一种强大的工具,可方便地检测由DNA片段化引起的细胞凋亡。该测定是非放射性且快速的。TUNEL分析使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)催化TF5-dUTP在片段DNA的游离3'-羟基末端的掺入。通过荧光显微镜(Cy5滤光片组)或用633或640 nm激光和660/20 nm滤光片(APC通道)进行流式细胞术分析所得的TF5标记的DNA。它的红色发射可以方便地与GFP标记的靶标多路复用。直接掺入荧光TF5标记的核苷酸可明显减少检测步骤。该试剂盒经过优化,可检测固定细胞和福尔马林固定,石蜡包埋的组织切片中的凋亡。

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适用仪器


流式细胞仪  
激发: 633/640nm激光
发射: 660/20nm
通道: APC通道
荧光显微镜  
激发: Cy5滤波片组
发射: Cy5滤波片组
推荐孔板: 黑色透明
 


产品说明书

样品分析方案

概述

根据需要处理样品

在冰上用4%甲醛溶液固定细胞30分钟

在冰上用70%冰冷的乙醇透化细胞60分钟

将TdT染色溶液添加到样品中并在37°C下孵育60分钟

使用带有Cy5滤光片组的荧光显微镜检测荧光强度 

 

工作溶液配制

TdT染色液
对于一项测试,混合以下试剂以使总体积为51 µL;
45 µL TdT反应缓冲液(组分D)
5 µL CoCl2(组分C)
0.5 µL TF5-dUTP(组分B)
0.5 µL TdT酶(组分A)。
注意:TdT染色溶液应立即使用。

 

操作步骤

细胞染色方案

以下方案可用作参考,实际情况应根据需要进行调整。

  1. 根据需要处理样品。
  2. 用您选择的缓冲液(例如含Ca+2和Mg+2的PBS)洗涤样品。
  3. 通过在PBS中加入100 µL 4%多聚甲醛固定样品,并在冰上孵育30分钟。
  4. 除去固定液并用PBS洗涤样品。
  5. 向样品中加入100 µL 70%的冰冷乙醇,并在冰上孵育60分钟。
    注意:样品在使用前可以在-20°C下保存几天。
  6. 除去酒精并用PBS洗涤细胞。
    注意:对于阳性对照,将固定样品与2-5 µg / mL DNAse在含有Ca +2和Mg +2的PBS中于37°C 孵育60分钟。除去DNAse并彻底清洗细胞,并继续进行其余操作。
  7. 向样品中加入50µL TdT染色溶液,并在37°C下孵育60至120分钟。
  8. 除去TdT工作溶液,并用PBS洗涤样品。
  9. 将样品重悬于PBS中,并使用流式细胞仪使用660/20 nm滤光片(APC通道)或带有Cy5滤光片组的荧光显微镜检测荧光强度。 

 

组织染色方案

以下方案可用作参考,实际应根据需要进行调整。


去石蜡和水化

  1. 通过将载玻片在Coplin广口瓶中在室温下浸入新鲜的二甲苯中5分钟,从而对组织切片(附着在载玻片上)进行脱蜡。再重复一次。(共2次洗涤)
  2. 将载玻片在室温下在Coplin广口瓶中浸入100%乙醇中5分钟,以洗涤样品。
  3. 通过在室温下将载玻片浸入各种浓度的酒精(100、95、85、70、50%)中,分别在室温下浸泡5分钟,从而对样品进行水化处理。
  4. 在室温下将载玻片浸入0.85%NaCl中5分钟,以洗涤样品。
  5. 在室温下将载玻片浸入PBS中5分钟,以洗涤样品。重复一遍。(共2次洗涤) 


固定

  1. 通过在室温下将载玻片浸入PBS中的4%多聚甲醛溶液中15-20分钟来固定组织切片。
  2. 在室温下将载玻片浸入PBS中5分钟,以洗涤样品。重复一遍。(共2次洗涤)
  3. 除去液体,然后将载玻片放在平坦的地方。用100 µL 20 µg / mL蛋白酶K溶液处理组织切片。(添加至足够覆盖整个组织表面。在室温下孵育载玻片10分钟。)
  4. 在室温下将载玻片浸入PBS中5分钟,以洗涤样品。
  5. 通过在室温下将载玻片浸入PBS中的4%多聚甲醛溶液中15-20分钟来固定组织切片。
  6. 在室温下将载玻片浸入PBS中5分钟,以洗涤样品。重复一遍。(共2次洗涤) 


染色

  1. 可选:对于阳性对照,将固定的样品与2-5 µg / mL的DNAse在含有Ca+2和Mg+2的PBS中于37°C 孵育60分钟。除去DNAse,并用PBS彻底清洗细胞,并继续进行其余操作。
  2. 向样品中加入50 µL TdT染色溶液,并在37°C下孵育60至120分钟。
  3. 除去TdT工作溶液,并用PBS洗涤样品。
  4. 加入含DAPI的封固剂(#20005),并用带Cy5滤光片组的荧光显微镜检测荧光强度。 

 

图示

图1.用   HeLa细胞进行TUNEL分析的荧光图像。 固定HeLa细胞,并在37°C下分别使用和不使用DNAse处理60分钟。然后将细胞用Cell Meter™固定细胞和组织TUNEL细胞凋亡测定试剂盒(Cat#22855)染色。DNA链断裂在DNAse处理的细胞中表现出强烈的荧光染色。使用Cy5滤光片组在荧光显微镜下检测信号。  

 

参考文献

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说明书
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