Screen Quest Fluo-8钙检测试剂盒 *适合于难检测细胞系*

货号36309存储条件f/l
规格100 Plates价格30876
Ex (nm)495Em (nm)516
分子量溶剂
产品详细介绍


简要概述

        Screen Quest Fluo-8钙检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的钙检测试剂盒,钙通量测定是用于筛选G蛋白偶联受体(GPCR)的药物发现中的优选方法。 Screen Quest Fluo-8 NW钙测定试剂盒提供均匀的荧光测定,用于检测细胞内钙动员。表达感兴趣的GPCR的细胞通过钙预先加载我们专有的Fluo-8 NW,其可以穿过细胞膜。 Fluo-8 NW是可用于HTS筛选的最亮钙指示剂。一旦进入细胞内,Fluo-8 NW的亲脂性阻断基团被非特异性细胞酯酶切割,产生带负电荷的荧光染料,其停留在细胞内,并且在与钙结合时其荧光大大增强。当用筛选化合物刺激细胞时,该受体表明细胞内钙的释放,这极大地增加了Fluo-8 NW的荧光。其长波长,高灵敏度和100-250倍荧光增加的特性(当它与钙形成复合物时)使Fluo-8 NW成为测量细胞钙的理想指标。这个Screen Quest Fluo-8 NW钙测定试剂盒提供了一种优化的检测方法,用于监测G蛋白偶联受体(GPCR)和钙通道。该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行,并且易于适应自动化。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的Screen Quest Fluo-8钙检测试剂盒。 



产品说明书

样品实验方案

简要概述

1.准备细胞
2.去除生长培养基
3.添加Fluo-8 NW染料工作溶液
4.在室温下孵育1小时
5.监测Ex / Em = 490 / 525nm处的荧光强度

 

溶液配制

1.储存溶液配制

除非另有说明,否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样,并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1.1 Fluo-8 NW配制:
对于Cat No.36307,将10μLDMSO加入Fluo-8 NW(组分A)中,并充分混合。
对于Cat No.36308和36309,将100μLDMSO加入Fluo-8 NW(组分A)中,并充分混合。 注意:10μLFluo-8 NW原液足以容纳1个平板。

1.2分析缓冲液储备液(1X):
对于Cat No.36307和36308,将9mL HHBS(组分C)加入10X Pluronic F127 Plus(1mL,组分B)中并充分混合。
对于Cat No.36309,将整瓶10XPluronic®F127Plus(10 mL,组分B)加入90 mL HHBS缓冲液(不包括在试剂盒中)中并充分混合。 注意:对于一个平板,10 mL的1X分析缓冲液就足够了。

 

2.工作溶液配制

将10μLFluo-8 NW DMSO储备溶液加入10mL 1X测定缓冲液中并充分混合。 该工作溶液在室温下稳定至少2小时。

 

操作步骤

1.有关细胞样品制备的指南,请点击查看。

2.从细胞板上除去生长培养基。注意:重要的是去除生长培养基,以最大限度地减少背景荧光和化合物对血清或培养基的干扰。注意:或者,在含有0.5%至1%FBS的生长培养基中培养细胞,以避免培养基去除步骤。在这种情况下,需要在HHBS缓冲液中加入2X染料。 [我们为那些在生长培养基中使用0.5%至1%FBS以避免培养基去除步骤的人提供2个独立的无洗涤钙测定试剂盒(目录号36315和目录号36316)。

3.将100μL/孔(96孔板)或25μL/孔(384孔板)的Fluo-8NW染料工作溶液加入到细胞板中。

4.将染料加载板在细胞培养箱中孵育30分钟,然后在室温下将板孵育另外30分钟。注意:如果测定需要37°C,立即进行实验,无需进一步室温孵育。注意:如果细胞在室温下运行时间较长,可在室温下孵育细胞培养板1-2小时(建议培养时间不超过2小时。)

5.用HHBS或所需缓冲液制备复合板。

6.通过监测Ex / Em = 490 / 525nm处的荧光强度来进行钙通量测定。注意:在实验之前运行信号测试很重要。不同的仪器有自己的强度范围。将信号测试强度调整到最大强度计数的10%至15%的水平。例如,FLIPR-384的最大荧光强度计数为65,000,因此应调整仪器设置以使其信号测试强度在7,000到10,000左右。

 

数据分析

        从空白标准孔获得的读数(RFU(Max-Min))用作阴性对照。 从其他标准的读数中减去该值,以获得基线校正值。 然后,绘制标准读数以获得标准曲线和方程。 该等式可用于计算卡巴胆碱剂量样品。 

图1.使用Screen Quest Fluo-8 NW Assay Kit和Fluo-4 NW Assay Kit在HEK-293细胞中测量Carbachol剂量反应。 将HEK-293细胞以40,000个细胞/100μL/孔接种在Costar黑壁/透明底96孔板中过夜。 除去生长培养基,使用Screen Quest Fluo 8-NW钙测定试剂盒或Fluo-4 NW试剂盒(根据制造商的说明书)将细胞与100μL染料上样溶液一起在室温下孵育1小时 温度。 通过NOVOstar(BMG Labtech)添加卡巴胆碱(25μL/孔)以达到最终指示的浓度。 Fluo8 NW的EC50约为1.2μM。

 

参考文献

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