Amplite 马来酰亚胺快速定量试剂盒 比色法

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产品优势

1.采用专有探针Maleimide Blue™（最大吸收峰~780 nm），实现了快速精准的定量分析

2.支持传统比色皿、NanoDrop™分光光度计、96孔UV透光板搭配酶标仪多种检测平台

 

适用范围

用于马来酰亚胺快速定量

 

产品介绍

含有马来酰亚胺基团的交联试剂被广泛用于蛋白质-蛋白质或蛋白质-其他生物分子的交联反应。该技术的核心挑战在于如何准确定量单个蛋白或抗体上连接的马来酰亚胺基团。传统方法虽可通过302 nm紫外分光光度法直接检测，但由于马来酰亚胺的摩尔消光系数较低（仅620 M⁻¹cm⁻¹），导致灵敏度不足，且蛋白在该波段的背景吸收会进一步干扰检测结果。

AAT Bioquest的Amplite®快速比色法马来酰亚胺定量试剂盒采用专有探针Maleimide Blue™（最大吸收峰~780 nm），实现了快速精准的定量分析。其技术原理为：Maleimide Blue™与马来酰亚胺修饰样本反应后，通过单次离心柱去除过量传感器，随后测定纯化产物的吸收光谱。根据780 nm（传感器）与280 nm（蛋白）或260 nm（核酸/寡核苷酸）的吸光度比值，即可计算出样本的马来酰亚胺结合比例。

Amplite®快速比色法马来酰亚胺定量试剂盒支持传统比色皿、NanoDrop™分光光度计、96孔UV透光板搭配酶标仪多种检测平台，目前已广泛应用于蛋白质、寡核苷酸及核酸样本的马来酰亚胺基团快速定量，为交联反应的质量控制提供高效解决方案。

实验方案

重要注意事项

储存条件：收到试剂盒后，Maleimide Blue™（组分A）需立即保存于-20°C（建议-80°C），避光防潮。正确储存下组分可稳定保存6个月。

注意：Spin Column（组分C）不可冷冻。

样本要求：每次检测需50-100 µg马来酰亚胺修饰的抗体或蛋白样本（pH=6.0缓冲体系，且不含游离马来酰亚胺）。

 

实验操作流程

样本准备

1.使用50至100μg马来酰亚胺样品（蛋白质或其他聚合物）。

2.使用分析缓冲液（组分B）将体积调节至100μL。

注意：马来酰亚胺连接的抗体或蛋白质样品应在pH = 6.0缓冲液中且不含游离马来酰亚胺。

 

马来酰亚胺检测反应

1.将马来酰亚胺样品加入一瓶马来酰亚胺蓝（组分A）中。

2.通过反复移液几次将其混均，或将小瓶涡旋几秒钟。

3.将反应混合物保持在室温下并旋转或摇动30-60分钟。

 

离心柱纯化准备

1.将旋转柱（组分C）反转几次以重悬沉淀的凝胶并除去任何气泡。

2.取下尖端，将柱子置于Washing Tube（2 mL，组分D）中，移除柱盖使填充缓冲液靠重力流至凝胶床顶部，若流速过慢，可重新插入并移除柱盖以启动流动，弃去流出液后将柱子放回洗涤管。若使用12×75 mm试管（需自备）需立即离心

3.  1000×g水平转子离心1分钟（参见离心参数说明），弃去缓冲液

4. 加入1 mL Assay Buffer（组分B），靠重力流出或离心1分钟，弃液，重复洗涤3-4次

5. 使用 水平转子离心机 以 1,000 × g 离心 2分钟（离心参数详见注意事项），弃去缓冲液。

注意1：

层析柱（组分C） 可适配 2 mL微量离心管 或 12 × 75 mm试管 用于离心收集。

初始平衡步骤 需使用随柱提供的 2 mL微量离心管

注意2：

适用于 Bio-Spin层析柱 的水平转子离心机需至少产生 1,000 × g 离心力。

特定转速（RPM）对应的离心力（g值）与转子半径相关，请查阅离心机说明书进行 RPM-g值换算，或按以下公式计算：

RCF(g) = (1.12 × 10⁻⁵) × (RPM)² × r

RCF：相对离心力（×g）

RPM：转子转速（转/分钟）

r：转子半径（厘米），测量点为转子中心至Bio-Spin柱中部距离

 

反应产物纯化步骤

1.将层析柱置于洁净的 1.5 mL收集管（组分E） 中。取 100 µL反应样品，缓慢加样至层析柱中心位置。

2.加样后，立即在柱顶端加入 10 µL检测缓冲液（组分B）。使用离心机以 1,000 × g 离心 5分钟，收集流出液至收集管中。

 

使用 0.2 mL 或 0.5 mL 石英比色皿进行吸收光谱测定：

1.根据比色皿尺寸（0.2 mL或0.5 mL石英比色皿）及预期吸光度值，用检测缓冲液（组分B） 将马来酰亚胺反应产物稀释 5-10倍。

注：稀释倍数不影响最终马来酰亚胺定量结果。

2.检测 900 nm至250 nm 范围内的吸收光谱。或仅读取 280 nm（蛋白特征峰）与 782 nm（马来酰亚胺加合物特征峰）的吸光度值。