iFluor Ultra 647 琥珀酰亚胺酯

货号71671存储条件 在零下15度以下保存, 避免光照
规格250 ug价格1140
Ex (nm)655Em (nm)670
分子量2634.28溶剂DMSO
产品详细介绍


简要概述

荧光染料缀合抗体是许多应用中鉴定蛋白质的一种工具,包括荧光细胞成像、流式细胞术、蛋白质印迹、免疫组织化学等。使用荧光标记抗体的优势包括更高的灵敏度、多路复用能力和易用性。 iFluor Ultra 系列是我们广受欢迎的 iFluor 染料的最新升级版,并针对用于荧光成像和流式细胞术应用的标记抗体进行了优化。用 iFluor Ultra 647 制备的抗体缀合物远远优于其他现有类似染料的缀合物,如 Alexa Fluor® 647。iFluor Ultra 647 缀合物在相同条件下比用 Alexa Fluor® 647 制备的缀合物更亮。此外,iFluor Ultra 647 的荧光不受 pH (4-10) 的影响。 iFluor Ultra 647 SE 染料相当稳定,并表现出与蛋白质氨基的良好反应性和选择性。 iFluor Ultra 647 的光谱特性和反应性类似于 Alexa Fluor® 647(Alexa Fluor® 是 ThermoFisher 的商标)。



产品说明书

实验方案

储备溶液配制

1. 蛋白质原液(溶液 A)
将 100 µL 反应缓冲液(例如,1 M 碳酸钠溶液或 1 M 磷酸盐缓冲液,pH ~ 9.0)与 900 µL 目标蛋白溶液(例如抗体,如果可能,蛋白质浓度 >2 mg/mL)混合,得到 1 mL 蛋白质标记原液。
注意:蛋白质溶液(溶液 A)的 pH 值应为 8.5 ± 0.5。如果蛋白质溶液的 pH 值低于 8.0,则使用 1 M 碳酸氢钠溶液或 1 M pH 9.0 磷酸盐缓冲液将 pH 值调整到 8.0-9.0 的范围内。
注意:蛋白质应溶于1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS),pH 7.2-7.4。如果蛋白质溶解在 Tris 或甘氨酸缓冲液中,则必须用 1X PBS,pH 7.2-7.4 进行透析,以去除用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐(如硫酸铵和醋酸铵)。
注意:如果蛋白质浓度低于 2 mg/mL,缀合效率会显着降低。为获得最佳标记效率,建议最终蛋白质浓度范围为 2-10 mg/mL。

2. iFluor Ultra 647 SE 原液(溶液 B)
将无水 DMSO 添加到 iFluor Ultra 647 SE 小瓶中,制成 10 mM 储备溶液。通过移液或涡旋混合均匀。
注意:在开始缀合之前准备染料储备溶液(溶液 B),并及时使用。染料原液的长期储存可能会降低染料活性。溶液 B 在避光和防潮的情况下可以在冰箱中储存两周,避免冻融循环。

  

操作步骤

该标记方案是为山羊抗小鼠 IgG 与 iFluor Ultra 647 SE 的缀合而开发的。 您可能需要进一步优化您的特定蛋白质。
注意:每种蛋白质需要不同的染料/蛋白质比例,这也取决于染料的特性。 蛋白质的过度标记会对其缀合亲和力产生不利影响,而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。

1.进行缀合反应
1.1使用 10:1 的溶液 B(染料)/溶液 A(蛋白质)的摩尔比作为起点:将 5 μL 的染料储备溶液(溶液 B,假设染料储备溶液为 10 mM)在有效摇动下倒入蛋白质溶液(95 µL 溶液 A)小瓶中。 假设蛋白质浓度为 10 mg/mL 且蛋白质的分子量为 ~200KD,则蛋白质的浓度为 ~0.05 mM。
注意:我们建议使用 10:1 摩尔比的溶液 B(染料)/溶液 A(蛋白质)。 如果太低或太高,分别确定最佳染料/蛋白质比例为 5:1、15:1 和 20:1。
1.2在室温下继续旋转或摇动反应混合物 30-60 分钟。

 

2.纯化缀合物
以下方案是使用 Sephadex G-25 柱进行染料-蛋白质缀合物纯化的示例。
根据制造说明准备 Sephadex G-25 柱。
2.1将反应混合物(来自“1.进行缀合反应”)加载到 Sephadex G-25 列的顶部。
2.2样品刚好在顶部树脂表面下方运行时,立即添加 PBS (pH 7.2-7.4)。
2.3向所需样品中添加更多 PBS (pH 7.2-7.4) 以完成柱纯化。 结合含有所需染料-蛋白质偶联物的组分。
注意:要立即使用,染料-蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释,并分装多次使用。
注意:对于长期储存,染料-蛋白质缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

 

3.数据处理

3.1表征所需的染料-蛋白质缀合物
取代度 (DOS) 是表征染料标记蛋白质的最重要因素。 较低 DOS 的蛋白质通常具有较弱的荧光强度,但较高 DOS 的蛋白质(例如 DOS > 6)也往往具有较低的荧光强度。 大多数抗体的最佳 DOS 建议在 2 到 10 之间,具体取决于染料和蛋白质的特性。 为了有效标记,应控制取代度,使 6-8 摩尔 iFluor Ultra 647 SE 对 1 摩尔抗体。 以下步骤用于确定 iFluor Ultra 647 SE 标记蛋白质的 DOS。

3.2吸收检测
要检测染料-蛋白质缀合物的吸收光谱,建议将样品浓度保持在 1-10 µM 的范围内,具体取决于染料的消光系数。

3.3读取 280 nm 处的 OD(吸光度)和染料最大吸光度(对于 iFluor Ultra 647 染料,ƛmax = 588 nm)
对于大多数分光光度计,样品(来自色谱柱馏分)需要用去离子水稀释,以便 OD 值在 0.1 到 0.9 的范围内。 OD(吸光度)在 280 nm 是蛋白质的最大吸收,而 588 nm 是 iFluor Ultra 647 SE 的最大吸收。 要获得准确的 DOS,请确保缀合物中不含非结合染料。

3.4计算DOS
您可以通过链接使用我们的工具计算DOS

 

参考文献

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说明书
iFluor Ultra 647 琥珀酰亚胺酯.pdf