Amplite NAD/NADH比率检测试剂盒(比色法)

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产品优势  

1.灵敏度高，在100 μL检测体系中可检测低至3 μM的NADH

2.兼容96孔或384孔微孔板形式

 

适用范围

用于NAD/NADH比率检测

 

产品介绍

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）是细胞中两种重要的辅因子。NADH是NAD+的还原形式，而NAD+是NADH的氧化形式。NADP是在腺苷核苷酸2'位通过酯键连接磷酸基团后形成的。NADP主要用于合成代谢反应（如脂肪酸和核酸合成），这些反应需要还原剂NADPH的参与。传统的NAD/NADH和NADP/NADPH检测方法是通过监测340 nm处NADH或NADPH的吸光度来实现的。该方法存在灵敏度低、干扰性强的缺点，因为检测需要在紫外波段进行，且必须使用昂贵的石英微孔板。

Amplite® NAD/NADH比率检测试剂盒提供了一种灵敏便捷的NAD、NADH及其比率检测方案。该试剂盒中的NADH探针是一种显色传感器，经NADH还原后可在~460 nm处产生最大吸光度。~460 nm处吸光度的增加量与溶液中NADH浓度成正比。该NADH探针无需酶参与反应即可识别NADH，信号可通过吸光酶标仪在~460 nm处直接读取。Amplite®比色法NADH检测试剂盒灵敏度高，在100 μL检测体系中可检测低至3 μM的NADH。本检测可采用便捷的96孔或384孔微孔板形式进行操作。

 

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吸光度酶标仪
吸光度:	460 nm
推荐孔板:	透明底板

细胞样品制备

关于细胞样本制备的指导原则，请访问：

https://www.aatbio.com/resources/guides/cell-samplepreparation.html

 

储备液配制

除非另有说明，所有未使用的储备液在配制后均应分装成单次使用量，并于-20°C保存。避免反复冻融。

NADH 标准品溶液 (1 mM)向 NADH 标准品（组分 C）瓶中加入 200 µL 1X PBS 缓冲液，配制成 1 mM (1 nmol/µL) 的 NADH 标准品溶液。

 

标准品溶液配制

为方便操作，可使用连续稀释规划工具：
https://www.aatbio.com/tools/serial-dilution/15273

 

NADH 标准品

取 50 µL 的 1 mM (1 nmol/µL) NADH 标准品溶液，加入 450 µL 1X PBS 缓冲液 (pH 7.4)，生成 100 µM (100 pmols/µL) NADH 标准品溶液。然后取 100 µM NADH 标准品溶液，用 1X PBS 缓冲液进行 1:2 的连续稀释，获得系列稀释的 NADH 标准品 (NS1 - NS7)。

注：稀释后的 NADH 标准品溶液不稳定，应在 4 小时内使用。

 

工作液配制

向 NAD/NADH 循环酶混合物（组分 A）瓶中加入 8 mL NADH 探针缓冲液（组分 B-II），混匀。

将 2 mL NADH 探针（组分 B-I）加入含组分 A+B-II 的瓶中，充分混匀，配制成 NAD/NADH 工作液。

注：此 NAD/NADH 工作液可进行 125-200 次检测。工作液稳定性较差，请随配随用并注意避光。

注：也可尝试使用适量超纯水（如 500 µL）溶解组分 A 后，再按比例与 B-II 和 B-I 混合配制适量 NAD/NADH 工作液。

 

样本实验方案

总 NAD+/NADH 检测（试剂盒规格：400 次检测/盒）：

表 1. 白色/透明底 96 孔微孔板中 NADH 标准品与测试样本的布局。
NS = NADH 标准品 (NS1 - NS7, 100 至 1.56 µM)
BL = 空白对照
TS = 测试样本

BL	BL	TS	TS
NS1	NS1	...	...
NS2	NS2	...	...
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

表 2. 各孔试剂组成。高浓度 NADH（例如，>100 µM，终浓度）会导致信号饱和并使标准曲线非线性。

1.根据表 1 和表 2 提供的布局，制备 NADH 标准品 (NS)、空白对照 (BL) 和测试样本 (TS)。

注： 按需制备细胞或组织样本。为方便起见，可使用裂解缓冲液（组分 G）裂解细胞，将细胞与裂解缓冲液在 37°C 下孵育 15 分钟，并使用上清液进行实验。

2.向 NADH 标准品、空白对照和测试样本的每个孔中加入 50 µL NAD/NADH 工作液，使总 NAD/NADH 检测体积为 100 µL/孔。

3.将反应体系在室温下避光孵育 15 分钟至 2 小时。

4.使用酶标仪在 460 nm 处监测吸光度的增加。

 

NAD/NADH 比率检测（试剂盒规格：250 次检测/盒）：

表 3. 白色/透明底 96 孔微孔板中 NADH 标准品与测试样本的布局。
NS = NADH 标准品 (NS1 - NS7, 100 至 1.56 µM)；
BL = 空白对照；
TS = 测试样本；
TS (NAD) = 用 NAD 提取溶液（组分 D）处理 10 至 15 分钟，然后用中和溶液（组分 E）中和的测试样本。

表 4. 各孔试剂组成。高浓度 NADH（例如，>100 µM，终浓度）会导致信号饱和并使标准曲线非线性。

各孔组成请参考表 3 和表 4。

对于 NAD 提取（NAD 含量）： 向含有测试样本的 NAD/NADH 孔中加入 25 µL NAD 提取溶液（组分 D）。在 37°C 下孵育 10 至 15 分钟，然后加入 25 µL 中和溶液（组分 E）以中和 NAD 提取物，如表 3 和表 4 所述。

对于总 NAD 和 NADH（总量）： 向 NADH 标准品和含有 NAD/NADH 的测试样本孔中加入 25 µL 提取对照溶液（组分 F）。在 37°C 下孵育 10 至 15 分钟，然后加入 25 µL 提取对照溶液（组分 F），如表 3 和表 4 所述。
注： 按需制备细胞或组织样本。为方便起见，可使用裂解缓冲液（组分 G）裂解细胞。

向 NADH 标准品、空白对照、测试样本 (NAD/NADH) 和测试样本 (NAD 提取物) 的每个孔中加入 75 µL NAD/NADH 工作液，使总检测体积为 150 µL/孔。

将反应体系在室温下避光孵育 15 分钟至 2 小时（我们在所示图中测试了 60 分钟）。

使用酶标仪在 460 nm 处监测吸光度的增加。