Amplite NADH检测试剂盒(比色法)

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产品优势  

1..在100 μL检测体系中可检测低至3 μM的NADH

2.兼容96孔或384孔微孔板检测模式

 

适用范围

用于NADH检测

 

产品介绍

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）是细胞内两种重要辅因子。NADH是NAD+的还原形式，而NAD+通过腺苷核苷酸2'位羟基的酯键磷酸化形成NADP。传统NAD/NADH与NADP/NADPH检测方法基于340 nm处NADH或NADPH吸光度的变化，但由于其紫外波段较短，导致检测灵敏度低且干扰性强。加之NAD和NADH吸光能力弱，紫外吸收法需大量样本，难以适用于微量检测。

AAT Bioquest品牌的Amplite®比色法NADH检测试剂盒提供了一种便捷的NADH检测方案。其NADH探针是一种显色传感器，经NADH还原后在460 nm处产生最大吸光度，该波段的吸光度增幅与溶液中NADH浓度成正比。该探针可通过非酶促反应特异性识别NADH，使用酶标仪在~460 nm处即可轻松读取信号。本试剂盒灵敏度高，在100 μL检测体系中可检测低至3 μM的NADH，并兼容96孔或384孔微孔板检测模式。

 

96孔板检测示例

概述

准备NADH反应混合物（50μL）

加入NADH标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育持续15分钟至2小时

监测460nm处的吸光度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个

 

操作步骤

1.准备NADH储备溶液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol / L）NADH储备溶液。

注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

 

2.准备NADH反应混合物：

将1mL NADH探针（组分A）加入4mL NADH测定缓冲液（组分B）中，并充分混合。

注意：5mL NADH反应混合物用于一个96孔。未使用的NADH反应混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

 

3.准备NADH标准品的系列稀释液（0至100μM）：

3.1将100μL的NADH储备溶液（来自步骤1）加入到400μLPBS缓冲液（pH 7.4）中，以产生200μM（100pmol / L）NADH标准溶液。

注意：稀释的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL的200μMNADH标准溶液进行1：2连续稀释，得到NADH标准品的100,50,25,12.5,6.25,3.13和0μM连续稀释液。

3.3如表1和2所述，将NADH标准品和含有NADH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔板中。

注意：根据需要制备细胞或组织样品。

 

表1.白色/透明底96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS
NS1	NS1	….	….
NS2	NS2
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

注意：NS = NADH标准，BL =空白对照，TS =测试样品。

 

表2.每个孔的试剂

孔	体积	试剂
NS1 - NS7	50 µL	连续稀释 (3.13 to 200 µM)
BL	50 µL	PBS
TS	50 µL	测试样品

*注意：将连续稀释的NADH标准品（3.13μM至200μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。

 

4.在上清液反应中运行NADH测定：

4.1将50μL的NADH反应混合物（来自步骤2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NADH测定体积为100μL/孔

注意1：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADH反应混合物。

注意2：根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见，裂解缓冲液（组分D）可用于裂解细胞。（详见附录）。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。

 

数据分析

        空白孔中的吸光度（仅用PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADH反应的那些孔的值中减去。 NADH标准曲线如图1所示。

图1。 使用SpectraMax酶标仪（Molecular devices），在96孔白色/透明底板中用Amplite ™比色NADH测定试剂盒测量NADH剂量反应。 孵育30分钟（n = 3）可以检测到低至3μM的NADH，在460nm处测量吸光度。

 

附录：使用组分G（NAD / NADH裂解缓冲液）的测试样品制剂

 

1.植物细胞样品：

用裂解缓冲液以200mg / mL均化，并以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测试。

 

2.样品：

离心收集细胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液，将处理后的溶液在室温下保持15分钟。以2500 rpm离心5分钟， 用上清液进行试验。

 

3.哺乳动物细胞样本：

从平板孔中取出培养基，每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液（或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔），并将处理过的溶液在室温下保持15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟，使用上清液进行测试。

 

4.组织样品：

称取约20mg组织，用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测定。