Amplite NAD+/NADH检测试剂盒(比色法)

货号15258存储条件f/l
规格400 Tests价格3720
Ex (nm)575Em (nm)
分子量溶剂
产品详细介绍


简要概述

        Amplite NAD+/NADH检测试剂盒(比色法)是AAT Bioquest研发的检测NAD+/NADH的试剂盒。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式,NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP,通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代谢生物反应,例如脂肪酸和核酸合成,其需要NADPH作为还原剂。 在叶绿体中,NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。 通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。

        传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定通过监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化来进行。 Amplite™荧光总NAD和NADH检测试剂盒为敏感检测NAD和NADH提供了一种便捷的方法。 系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NAD / NADH,其显着提高了检测灵敏度。 此外,该测定具有非常低的背景,因为其在红色可见范围内运行,这显着降低了生物样品引起的干扰。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的Amplite NAD+/NADH检测试剂盒。 

Amplite™比色NAD / NADH检测试剂盒提供灵敏的一步法检测,可在100μL检测体积(300 nM;图1)中检测少至30皮摩尔的NAD(H)。 可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行测定。 其信号可通过吸光度酶标仪在~575nm或~570nm至~605nm的吸光度比下轻松读取,以提高测定灵敏度。



产品说明书

96孔板测定示例

 

概述

准备NAD / NADH反应混合物(50μL)

添加NADH标准品或测试样品(50μL)

在室温下孵育15分钟--2小时

监测Ex / Em = 540 / 590nm处的荧光强度

 

操作方法

1.准备NADH储备溶液:

将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品(组分C)的小瓶中,得到1mM(1nmol / L)NADH储备溶液。

注意:未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.准备NAD / NADH反应混合物:

将10mL NAD / NADH传感器缓冲液(组分B)加入NAD / NADH再循环酶混合物(组分A)的瓶中,并充分混合。

注意:NAD / NADH反应混合物足以用于两个96孔板。 未使用的NAD / NADH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

3.准备NADH标准品的系列稀释液(0至10μM):

3.1将10μL的NADH储备溶液(来自步骤1)加入到990L PBS缓冲液(pH 7.4)中,以产生10μM(10pmol / L)NADH标准溶液。

注意:稀释的NADH标准溶液不稳定,应在4小时内使用。

3.2取200μL10μMNADH标准溶液进行1:3连续稀释,得到NADH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM连续稀释液。

3.3如表1和2中所述,将含有NADH标准品和含NAD / NADH的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中。

注意:根据需要准备细胞或组织样本。

 

表1实心黑色96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

BL

BL

TS

TS

NS1

NS1

….

….

NS2

NS2

 

 

NS3

NS3

 

 

NS4

NS4

 

 

NS5

NS5

 

 

NS6

NS6

 

 

NS7

NS7

 

 

注意:NS = NADH标准,BL =空白对照,TS =测试样品。

 

表2.每个孔的试剂组成

NADH Standard

Blank Control

Test Sample

Serial Dilutions*: 50 μL

PBS: 50 μL

50 μL 

注意:将连续稀释的NADH标准品(0.01μM至10μM)加入NS1至NS7的孔中,一式两份。 高浓度的NADH(例如,>100μM,最终浓度)可能由于NADH传感器(对非荧光产物)的过度氧化而导致荧光信号降低。

 

4.在上清液反应中运行NAD / NADH测定:

4.1将50μL的NADH反应混合物(来自步骤2)加入NADH标准品,空白对照和测试样品(来自步骤3.3)的每个孔中,使得总NADH测定体积为100μL/孔。

注意:对于384孔板,每孔加入25μL样品和25μLNADH反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时,避光。

4.3用Ex / Em = 540 / 590nm的荧光板读数器监测荧光增加。

注1:也可将板的内容物转移到白色透明底板上,用吸光度酶标仪在576±5nm波长下读数。 与荧光读数相比,吸收检测具有较低的灵敏度。

注意2:对于NAD / NADH比率测量,建议使用试剂盒15263。

注意3:对于基于细胞的NAD / NADH测量,建议使用ReadiUse™哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *(目录号20012)裂解细胞。

 

数据分析

        空白孔中的荧光(仅用PBS缓冲液)用作对照,并从具有NADH反应的那些孔的值中减去。 NADH标准曲线如图1所示。

注意:荧光背景随时间增加,因此减去每个数据点的空白孔的荧光强度值是很重要的。

图1.使用NOVOStar酶标仪(BMG Labtech),在固体黑色96孔板中用Amplite™总NAD和NADH测定试剂盒测量NADH剂量反应。 在孵育1小时(n = 3)时可以检测到低至100nM(10pmol /孔)的NADH,而NADPH没有响应。

 

试剂应用文献

AMPK activation protects cells from oxidative stress-induced senescence via autophagic flux restoration and intracellular NAD+ elevation
Authors: Han, Xiaojuan and Tai, Haoran and Wang, Xiaobo and Wang, Zhe and Zhou, Jiao and Wei, Xiawei and Ding, Yi and Gong, Hui and Mo, Chunfen and Zhang, Jie and others
Journal: Aging cell (2016): 416--427

 

参考文献

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Authors: Davoud Sanajou, Amir Ghorbani Haghjo, Hassan Argani, Leila Roshangar, Nadereh Rashtchizadeh, Saeed Nazari Soltan Ahmad, Zahra Ashrafi-Jigheh, Saman Bahrambeigi, Farshid Asiaee, Jalil Rashedi
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Functional analysis of the mitochondrial alternative oxidase gene (aox1) from Aspergillus niger CGMCC 10142 and its effects on citric acid production
Authors: Li Hou, Ling Liu, Hongfei Zhang, Lin Zhang, Lan Zhang, Jian Zhang, Qiang Gao, Depei Wang
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A Snapshot of the Plant Glycated Proteome STRUCTURAL, FUNCTIONAL, AND MECHANISTIC ASPECTS
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Journal: Journal of Biological Chemistry (2016): 7621--7636

 

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说明书
Amplite NAD+/NADH检测试剂盒(比色法).pdf