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Amplite 荧光法cADP-核糖检测试剂盒

英文名称:Amplite® Fluorimetric cADP-Ribose Assay Kit
产品参数
Ex (nm)-Em (nm)-
分子量-溶剂-
存储条件-
产品概述

Amplite 荧光法cADP-核糖检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测核糖的试剂盒,cADP-核糖(cADPR)是衍生自NAD +的新型Ca2 +信使。 ADP-核糖基环化酶(ADPRC)催化从NAD +合成cADPR,但是在高浓度烟酰胺存在下,该反应可以逆转,从化学计量上从cADPR产生NAD +。 可以使用我们新开发的NAD传感器Quest Fluor NAD试剂检测生成的NAD +。 这使得可以在低nM范围内监视组织和细胞培养物中的cADPR。 使用Quest Fluor NAD试剂进行的NAD +检测对NAD +具有特异性,对NADH无反应。 荧光信号可以容易地检测到。 该测定可以在方便的96孔或384孔微量滴定板中进行。

 

适用仪器


荧光酶标仪  
Ex: 420 nm
Em: 480 nm
Cutoff: 435 nm
推荐孔板: 纯黑车孔板
实验方案

样品实验方案

简要概述

1.准备并添加cADPR标准和/或测试样品(50 µL)
2.准备并添加ADRPC工作溶液(50 µL)
3.在室温下孵育1小时
4.添加40 µL Quest Fluor NAD探针
5.添加40 µL测定溶液
6.在室温下孵育20分钟
7.添加30 µL增强剂溶液
8.在室温下孵育20分钟
9.在Ex / Em = 420/480 nm处监控荧光强度

 

溶液制备

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样,并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。
cADPR标准储备溶液(5 mM):
将10 µL ddH2O加入cADPR标准样品瓶(组分F)中,并充分混合。 注意:未使用的cADPR储备溶液应以-20℃一次等份保存。

2.标准溶液

cADPR标准
注意:在测定溶液I(组分C)中准备cADPR系列稀释液。

3.工作溶液

ADPRC工作溶液:
将50 µL ddH2O加入ADPRC酶混合物(组分B)的小瓶中,并充分混合。 将全部内容物转移到5毫升测定溶液I(组分C)中,并充分混合。 注意:ADPRC工作溶液不稳定,请立即使用。

 

样品示例及操作

表1.黑色96孔微孔板中cADPR标准品和测试样品的布局。 ST = cADPR标准(ST1-ST7); BL =空白对照; TS =测试样品。

BL BL TS TS
ST1 ST1 ... ...
ST2 ST2 ... ...
ST3 ST3    
ST4 ST4    
ST5 ST5    
ST6 ST6    
ST7 ST7    

表2.每个孔的试剂组成

容积 试剂
ST1-ST7 50ul 连续稀释
BL 50ul 分析溶液I(组分C)
TS 50ul 测试样品

NAD生成测定

1.将50 µL cADPR标准液,空白对照和测试样品加到黑色固体96孔微孔板中(如表1和表2所示)。

2.在cADPR标准品,空白对照和测试样品的每个孔中添加50 µL /孔的ADPRC工作溶液。 注意:对于384孔板,请在每个孔中加入12.5 µL样品和12.5 µL ADPRC反应混合液。

3.避光保存,室温下孵育反应60分钟。

NAD检测分析

1.将40 µL Quest Fluor NAD探针(组分A)添加到cADPR标准品,空白对照和测试样品的每个孔中(总计140 µL /孔),并充分混合。

2.向每个孔中加入40 µL分析溶液II(组分D)(总量为180 µL /孔),混合均匀。 注意:对于384孔板,将10 µL Quest Fluor NAD探针和10 µL分析溶液II加到每个孔中。

3.避光保存,室温下孵育反应10-20分钟。

4.向每个孔中添加30 µL增强剂溶液(组分E),使总NAD测定体积为210 µL /孔,并在避光的条件下在室温下孵育10-20分钟。 注意:对于384孔板,请添加7.5 µL增强剂溶液。

使用荧光板读数器在420/480 nm处监测荧光的增加。

 

参考文献

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