Amplite 硝基还原酶检测试剂盒*生物发光法*

硝基还原酶（NTR）是一类参与含氮化合物还原的相关蛋白。它们在哺乳动物细胞中不存在，但在细菌中广泛存在。硝基还原酶在通过NAD（P）H依赖反应还原硝基芳香化合物中起着关键作用。NTR也是开发新型抗生素、降解污染物和癌症治疗的靶点。尽管NTR的定量在许多生物应用中变得极其重要，但目前大多数NTR检测都是基于低灵敏度和低吞吐量的ELISA实验。Amplite 硝基还原酶检测试剂盒为定量NTR活性提供了一种高灵敏度、简便的方法。该试剂盒使用一种荧光素衍生物，可被NTR荧光素选择性地还原。利用已知的荧光素酶检测系统可以方便地检测荧光素酶的生成量，它的发光强度与NTR活性成正比。该Amplite 硝基还原酶检测试剂盒具有最少的操作时间和稳定的发光信号。它能检测到低至20ng/mL的NTR。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的NTR检测试剂盒。 

 

适用仪器

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发光酶标仪
推荐孔板:	纯白色孔板

样品实验方案

简要概述

1.制备NTR储备溶液

2.添加NTR标准或NTR测试样品（50µL/孔）

3.添加NTR反应工作溶液（50µL/孔）

4.在37°C下孵育60分钟

5.准备NTR检测工作溶液

6.添加NTR检测工作溶液（50µL/孔）

7.立即检测发光强度

注：开始实验前，在室温下解冻所有试剂盒组份。

 

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1.1 NTR储备溶液（100X）

将50µL DMSO（组分H）加入NTR底物（组分A）小瓶中，制成100倍NTR底物储备溶液。

1.2 NTR反应酶储备溶液（100X）

将50µL NTR反应缓冲液（组分B）添加到NTR反应酶（组分C）小瓶中，制成100X NTR反应酵素储备溶液。

1.3 NTR检测Mix 1储备溶液（100X）

将22.7μL的3％H₂O₂（0.88M，组分B）加入977μL的测定缓冲液（组分C）中以制备20mM H₂O₂储备溶液。 注意：稀释的H₂O₂溶液不稳定。 应丢弃未使用的部分。

1.4 硝酸还原酶标准溶液（250µg/mL）

向硝酸还原酶标准品（组分G）小瓶中加入20µL ddH2O，制成250µG/mL硝酸还原素标准溶液。

 

2.标准溶液

为方便起见，请使用串行稀释计算器： https://www.aatbio.com/tools/serial-dilution/12470

2.1 硝酸还原酶标准溶液

将10µL 250µg/mL硝酸还原酶标准溶液添加到240µL NTR反应缓冲液（组分B）中，生成10µg/mL硝酸还原蛋白酶标准溶液（NS7）。然后取10µg/mL硝酸还原酶标准溶液（NS7），在NTR反应缓冲液（组分B）中进行1:3的连续稀释，以获得连续稀释的硝酸还原蛋白酶标准溶液（NS2-NS7）。注：稀释的NTR标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

 

3.工作溶液

3.1 NTR反应工作溶液

向5 mL NTR反应缓冲液（组分B）中加入50µL的100X NTR底物储备液和50µL的100X NT R反应酶储备液，以使总体积为5.1 mL的NTR反应工作溶液。

3.2 NTR检测工作溶液

将50µL 100X检测混合物1和10µL检测混合物2（组分F）添加到5 mL NTR检测缓冲液（组分D）中，使总体积为5.05 mL NTR-检测工作溶液。

 

样品分析

表1.NTR标准品和测试样品在纯白色96孔微孔板中的布局。NS=NTR标准品（NS7-NS1，0.001至10µg/mL）；BL=空白对照；TS=试样

BL	BL	TS	TS
NS1	NS1	...	...
NS2	NS2	...	...
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

表2.每个孔的试剂组成

孔	容积	试剂
NS1-NS7	50ul	连续稀释液（10 to 0.001 µg/mL）
BL	50ul	NTR反应缓冲液（组分B）
TS	50ul	测试样品

1.根据表1和表2中提供的布局，制备NTR标准品（NS）、空白对照品（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每个孔使用12.5µL试剂，而不是50µL。

2.向NTR标准品、空白对照品和测试样品的每个孔中加入50µL NTR反应工作溶液。对于384孔板，在每个孔中加入12.5µL NTR反应工作溶液。

3.在37°C下避光孵育反应60分钟。

4.向每个孔中加入50µL NTR检测工作溶液，使总分析体积为150µL/孔。对于384孔板，向每个孔中加入12.5µL检测工作溶液，总体积为37.5µL/孔。

5.立即用发光酶标仪检测。