Amplite 荧光法通用型蛋白酶活性检测试剂盒 绿色荧光

蛋白酶测定法广泛用于蛋白酶抑制剂的研究和蛋白酶活性的检测。监测各种蛋白酶活性已成为许多生物实验室的常规任务。 一些蛋白酶已被确定为良好的开发目标。

我们的Amplite 通用荧光蛋白酶活性检测试剂盒是进行常规检测分离蛋白酶或鉴定蛋白质样品中污染蛋白酶的理想选择。该试剂盒使用荧光酪蛋白偶联物，其被证明是广谱蛋白酶（例如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，蛋白酶K，蛋白酶XIV和弹性蛋白酶）的通用底物。在完整的底物中，酪蛋白用绿色荧光染料严重标记，导致显着的荧光猝灭。蛋白酶催化的水解减轻了其猝灭效应，产生明亮的荧光染料标记的短肽。荧光强度的增加与蛋白酶活性成正比。 该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行，并且易于适应自动化。使用FITC滤光片组，可以使用荧光酶标仪在Ex / Em = 490/525 nm下轻松读取其信号。

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适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	490nm
Em:	525nm
Cutoff:	515nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

一个96孔板的测定方案

以下说明书仅提供指南，实际应根据您的具体需求进行修改。

概述（方案A）

检测样品中的蛋白酶活性

准备蛋白酶底物溶液 (50 µL)

添加底物对照、阳性对照或测试样品 (50 µL)

跳过孵育以进行动力学读数或孵育 30 至 60 分钟以进行终点读数

在 Ex/Em = 490/525 nm 处检测荧光强度

 

概述（方案B）

使用纯化酶筛选蛋白酶抑制剂

准备蛋白酶底物溶液 (10 µL)

添加底物对照、阳性对照、载体对照或测试样品 (90 µL)

跳过孵育以进行动力学读数或孵育 30 至 60 分钟以进行终点读数

在 Ex/Em = 490/525 nm 处检测荧光强度 

 

工作溶液配制

在 2X 检测缓冲液（组分 C）中以 1:100 的比例稀释蛋白酶底物（组分 A）。在 96 孔板中，每次测定使用 50 μL 的蛋白酶底物溶液。 
注意：2X 检测缓冲液（组分 C）设计用于检测糜蛋白酶、胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、蛋白酶 K、蛋白酶 XIV 和人类白细胞弹性蛋白酶的活性。对于其他蛋白酶，请参阅下表 1 以了解适当的测定缓冲液配方。 

在去离子水中以 1:50 的比例稀释胰蛋白酶（5 U/µL，组分 B），以获得 0.1 U/µL 的浓度。

将 5 mL 去离子水加入 5 mL 的 2X 检测缓冲液（组分 C）中。

在 1X 检测缓冲液中以 1:20 稀释蛋白酶底物（组分 A）。对 96 孔板使用 10 μL/孔的蛋白酶底物溶液。
注意：2X 测定缓冲液（组分 C）设计用于检测糜蛋白酶、胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、蛋白酶 K、蛋白酶 XIV 和人类白细胞弹性蛋白酶的活性。对于其他蛋白酶，请参阅下表 1 以了解适当的测定缓冲液配方。

将 1X 检测缓冲液中的蛋白酶稀释至 500-1000 nM 的浓度（对于胰蛋白酶 50-100 U/mL）。每孔需要 10 μL 的蛋白酶稀释液。为所有测试样品准备适当的量，为阳性对照和载体对照孔准备额外的量。

表1.蛋白酶的检测缓冲液配方。对于方案 A，需要 2X 检测缓冲液。对于方案 B，需要 1X 检测缓冲液。

蛋白酶	1X 检测缓冲液
组织蛋白酶D	20 mM 柠檬酸钠，pH 3.0
木瓜蛋白酶	20 mM 乙酸钠、20 mM 半胱氨酸、2 mM EDTA，pH 6.5
PAE	20 mM 磷酸钠，pH 8.0
胃蛋白酶	10 mM 盐酸，pH 2.0
猪胰腺弹性蛋白酶	10 mM Tris-HCl，pH 8.8
枯草杆菌蛋白酶	20 mM 磷酸钾缓冲液，pH 7.6，150 mM NaCl

 

方案二：使用纯化酶筛选蛋白酶抑制剂

概述

准备蛋白酶底物溶液（10μL）添加底物对照，阳性对照，载体对照或测试样品（90μL）

孵育0分钟（用于动力学读数）或30分钟-1小时（用于终点读数）

监测Ex的荧光强度 / Em = 490 / 525nm

 

操作方法

方案 A：检测样品中的蛋白酶活性

表2. 96 孔板中底物对照、阳性对照和测试样品的布局。SC=底物对照，PC=阳性对照，TS=测试样品。

SC	SC	...	...
PC	PC	...	...
TS	TS
...	...

表3.每孔的试剂组成。如果使用少于 50 µL 的蛋白酶生物样品，添加 ddH₂O 使总体积为 50 µL。

孔	体积	试剂
SC	50 µL	去离子水
PC	50 µL	胰蛋白酶稀释液
TS	50 µL	含蛋白酶溶液

1.在测定板的所有孔中加入 50 μL 的蛋白酶底物溶液（方案A）。充分混合试剂。

2.在Ex/Em = 490/525 nm 处使用荧光酶标仪检测荧光。 对于动力学读数：立即开始连续测量荧光强度并每 5 分钟记录一次数据，持续 30 分钟。 对于终点读数：在所需温度下孵育反应 30 至 60 分钟，避光。然后测量荧光强度。 

 

方案 B：使用纯化酶筛选蛋白酶抑制剂

表4. 96 孔微孔板中样品的布局。SC=底物对照，PC=阳性对照，VC=载体对照，TS=测试样品。建议测试每种测试化合物的至少三种不同浓度。所有测试样品应一式两份或一式三份进行。

SC	SC	...	...
PC	PC	...	...
VC	VC
TS	TS
...	...

表5.每孔的试剂组成。对于添加到孔中的每一体积的测试化合物，需要检查用于递送测试化合物的相同体积的溶剂以了解载体对蛋白酶活性的影响。

孔	体积	试剂
SC	90 µL	检测缓冲液 (1X) (90 µL)
PC	90 µL	检测缓冲液 (1X) (80 µL) 蛋白酶稀释液 (10 µL)
VC	90 µL	载体 (X µL) 检测缓冲液 (80 - X µL) 蛋白酶稀释 (10 µL)
TS	90 µL	测试化合物 (X µL) 检测缓冲液 (1X) (80 - X µL) 蛋白酶稀释液 (10 µL)

1.在阳性对照 (PC)、对照 (VC) 和测试样品 (TS) 的孔中加入 10 μL 的蛋白酶底物溶液（方案B）。充分混合试剂。

2.在 Ex/Em = 490 /525 nm 处使用荧光酶标仪检测荧光强度。 对于动力学读数：立即开始连续测量荧光强度并每 5 分钟记录一次数据，持续 30 分钟。 对于终点读数：在所需温度下孵育反应 30 至 60 分钟，避光。然后测量荧光强度。 

 

参考文献

IL-33, IL-25 and TSLP contribute to development of fungal-associated protease-induced innate-type airway inflammation
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Tranexamic acid blocks the thrombin-mediated delay of epidermal permeability barrier recovery induced by the cedar pollen allergen, Cry j1
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Eosinophil extracellular trap cell death--derived DNA traps: Their presence in secretions and functional attributes
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Japanese Cedar (Cryptomeria japonica) pollen allergen induces elevation of intracellular calcium in human keratinocytes and impairs epidermal barrier function of human skin ex vivo
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Journal: Archives of dermatological research (2016): 49--54

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Incorporation of proteinase inhibitors into silk-based delivery devices for enhanced control of degradation and drug release
Authors: Eleanor M Pritchard, Thomas Valentin, Detlev Boison, David L Kaplan
Journal: Biomaterials (2011): 909--918

 

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