Cell Meter 固定细胞和组织TUNEL细胞凋亡检测试剂盒*红色荧光*

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适用范围

适用于固定细胞样本以及福尔马林固定石蜡包埋组织切片的凋亡研究

产品介绍

Cell Meter™固定细胞和组织TUNEL细胞凋亡检测试剂盒为DNA片段化引起的凋亡检测提供了一种便捷、快速且非放射性的高效工具。

TUNEL 检测利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）催化 TMR-dUTP 掺入片段化 DNA 的游离 3'- 羟基末端。生成的 TMR 标记 DNA 可通过荧光显微镜（使用 Cy3 或 TRITC 滤光片组）进行分析。其红色荧光发射信号可地与 GFP 标记的靶标进行多重检测。直接掺入荧光 TMR 标记的核苷酸显著减少了检测步骤。

Cell Meter™固定细胞和组织TUNEL细胞凋亡检测试剂盒经过优化，适用于固定细胞及福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的凋亡检测。

样品分析方案

概述

根据需要处理样品

在冰上用4％甲醛溶液固定细胞30分钟

在冰上用70％冰冷的乙醇透化细胞60分钟

将TdT染色溶液添加到样品中并在37°C下孵育60分钟

使用Cy3滤光片组的荧光显微镜检测荧光强度 

工作溶液配制方案

对于1test，混合以下试剂以使总体积为51 µL；
45 µL TdT反应缓冲液（组分D）
5 µL CoCl ₂  （组分C）
0.5 µL TF5-dUTP（组分B）
0.5 µL TdT酶（组分A）。
注意：TdT染色溶液应立即使用。

操作步骤

1.根据需要处理样品。

2.用您选择的缓冲液（例如含Ca ⁺²和Mg ^+2的 PBS）洗涤细胞。

3.通过在PBS中加入100 µL 4％多聚甲醛固定细胞，并在冰上孵育30分钟。

4.除去固定液并用PBS洗涤细胞。

5.向细胞中加入100 µL 70％的冰冷乙醇，并在冰上孵育60分钟。

注意：在使用前，可将细胞在此步骤中于-20°C存放几天。

6.除去乙醇并用PBS洗涤细胞。

注意：对于阳性对照，将固定细胞与2-5 µg / mL的DNAse在含有Ca ⁺²和Mg ⁺²的PBS中于37°C 孵育60分钟。除去DNAse并彻底清洗细胞，然后继续执行其余的操作步骤。

7.向细胞中加入50 µL TdT染色溶液，并在37°C下孵育60至120分钟。

8.除去TdT工作溶液，并用PBS洗涤细胞。

9.将细胞重悬于PBS中，并使用流式细胞仪575/26 nm滤光片（PE通道）  或荧光显微镜Cy3滤光片组检测荧光强度。 

组织染色方案

脱蜡复水流程

1.将载玻片置于Coplin广口瓶中，新鲜二甲苯浸泡5分钟（室温），从而对组织切片（附着在载玻片上）进行脱蜡，重复一次（共2次洗涤）

2.将载玻片在室温下在Coplin广口瓶中浸入100％乙醇中5分钟，以洗涤样品。

3.通过在室温下将载玻片依次浸入不同浓度乙醇：（100％，95％，85％，70％，50％）中，然后分别在室温下浸没5分钟，使样品重新水化。

4.在室温下将载玻片浸入0.85％NaCl中5分钟，以洗涤样品。

5.在室温下将载玻片浸入PBS中5分钟，以洗涤样品。重复一遍。（共2次洗涤） 

固定方案

1.通过在室温下将载玻片浸入PBS中的4％多聚甲醛溶液中15-20分钟来固定组织切片。

2.在室温下将载玻片浸入PBS中5分钟，以洗涤样品。重复一遍。（共2次洗涤）

3.除去液体，然后将载玻片放在平坦的表面上。用100 µL 20 µg / mL蛋白酶K溶液处理组织切片。添加足够覆盖整个组织表面。在室温下孵育载玻片10分钟。

4.在室温下将载玻片浸入PBS中5分钟，以洗涤样品。

5.通过在室温下将载玻片浸入PBS中的4％多聚甲醛溶液中15-20分钟来固定组织切片。

6.在室温下将载玻片浸入PBS中5分钟，以洗涤样品。重复一遍。（共2次洗涤） 

染色方案

可选：对于阳性对照，将固定的样品与2-5 µg / mL的DNAse在含有Ca ⁺²  和Mg ⁺²的PBS中于37°C 孵育60分钟。除去DNAse，并用PBS彻底清洗细胞，并继续进行其余操作。

向样品中加入50 µL TdT染色溶液，并在37°C下孵育60至120分钟。

除去TdT工作溶液，并用PBS洗涤样品。

加入含DAPI的封固剂（AAT Bioquest Cat＃20005），并用Cy3滤光片组检测荧光强度荧光显微镜

试剂应用文献