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Cell Meter 活细胞Caspase 3/7和磷脂酰丝氨酸PS检测试剂盒

英文名称:Cell Meter™ Live Cell Caspase 3/7 and Phosphatidylserine Detection Kit *Triple Fluorescence Colors*
产品参数
Ex (nm)-Em (nm)-
分子量-溶剂-
存储条件在零下15度以下保存, 避免光照
产品概述

我们的Cell Meter 检测试剂盒是一套用于检测细胞功能的工具。在凋亡过程中,关键事件之一是胱天蛋白酶。 caspase 3/7对于凋亡的启动很重要。已经证明胱天蛋白酶3/7对肽序列Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)具有底物选择性。该试剂盒使用SR-DEVD-FMK作为荧光指示剂来检测caspase 3/7活性。 SR-DEVD-FMK具有细胞渗透性和无毒性,一旦与胱天蛋白酶结合,荧光试剂就会保留在细胞内。结合后阻止了胱天蛋白酶的进一步催化,但不会阻止凋亡的进行。 SR-DEVD-FMK是红色荧光标记试剂。膜联蛋白是在钙存在下与磷脂膜结合的蛋白质家族。 Annexin V用于检测在细胞表面表达磷脂酰丝氨酸(PS)的凋亡细胞。 PS在细胞表面上的出现是细胞凋亡的初始/中间阶段的普遍指标。 Annexin V-dye缀合物通过测量PS的转运来检测细胞凋亡。该试剂盒中使用的Annexin V-iFluor 488 是绿色标记试剂,Ex / Em = 490/525 nm。该试剂盒旨在通过同时检测哺乳动物细胞中的Caspase 3/7和Annexin V活性来检测凋亡。该试剂盒还提供了一种Hoechst染料,用于标记整个细胞群体的细胞核;以及碘化丙啶染料,用于对坏死细胞进行染色。该试剂盒适用于荧光显微镜,流式细胞仪和荧光酶标仪。该试剂盒为所有必需成分提供了优化的测定方案。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供优质的Cell Meter 活细胞Caspase 3/7和磷脂酰丝氨酸PS检测试剂盒。

 

适用仪器


流式细胞仪  
Ex: 488 nm
Em: 530/30 nm、575/26 nm、610/20 nm  
通道: FITC, PE, PE-Texas Red 通道

 


荧光显微镜

推荐孔板: 黑色透明底板
通道: FITC 通道用于 Annexin V-iFluor 488™,TRITC 通道用于 TF3-DEVD-FMK

 


荧光酶标仪

 
Ex: 490 nm, 550 nm
Em: 525 nm, 595 nm
Cutoff: 515 nm, 570 nm
推荐孔板: 黑色透明底板
读取模式: 底读模式
实验方案

样品实验方案

简要概述

  1. 用2×106细胞/ mL的密度制备含测试化合物的细胞
  2. 以1:150的比例添加TF3-DEVD-FMK和/或Annexin V-iFluor 488,以1:100的比例添加到细胞溶液中
  3. 将细胞在37°C,5%CO2培养箱中孵育1小时。
  4. 沉淀细胞,用缓冲液或生长培养基洗涤并重悬细胞
  5. 使用带有FITC和TRITC滤光片的荧光显微镜或带有FL1的流式细胞仪和膜联蛋白V-iFluor 488 和TF3-DEVD-FMK的FL2通道,检测Ex / Em = 490/525 nm(截止= 515 nm)或550/595 nm(截止= 570 nm)的荧光强度(底部读取模式)。

 

溶液配制

储备溶液配制

1. TF3-DEVD-FMK储备溶液(150X):将200 µL DMSO加入小瓶TF3-DEVD-FMK(组分A)中,制成150X TF3-DEVD-FMK储备液。

 

实验步骤

1.根据您的特定诱导方案,将细胞培养至最适合凋亡诱导的密度,但在96孔板上不超过2 x 106细胞/ mL(或不超过3 x 105细胞/ 100 µL /孔) )。 同时,在每种标记条件下,用诱导群体相同的密度培养非诱导阴性对照细胞群体。 以下是在悬浮培养中诱导细胞凋亡的一些例子:
a.用2 µg / ml喜树碱处理Jurkat细胞3小时。
b.用1 µM星形孢菌素处理Jurkat细胞3小时。
c.用4 µg / ml喜树碱处理HL-60细胞4小时。
d.用1 µM星形孢菌素处理HL-60细胞4小时。 注意:应单独评估每种细胞系,以确定诱导凋亡的细胞密度。

2.以1:150的比例添加150X TF3-DEVD-FMK储备溶液和或以1:100的比例将Annexin V-iFluor 488 (组分B)添加到每个孔中。

3.将细胞在37°C,5%CO2培养箱中孵育1小时。 注意:对于TF3-DEVD-FMK标记,细胞可以浓缩至约5 X 106细胞/ mL。 对于贴壁细胞,用0.5 mM EDTA轻轻提起细胞以保持细胞完整,并在与TF3-DEVD-FMK孵育之前用含血清的培养基洗涤一次。 合适的孵育时间取决于所用的单个细胞类型和细胞浓度。 优化每个实验的孵育时间。 贴壁细胞的膜联蛋白V流式细胞仪分析未经过常规测试,因为在细胞分离或收获过程中可能会发生特定的膜损伤。

4.如果需要,用DNA染色剂标记细胞(例如,对于整个细胞核染色剂,使用Hoechst标记,或者如果仅用Annexin V-iFluor 488 标记细胞,则用碘化丙啶标记死细胞)。

5.以约200g的转速旋转细胞2分钟,并用1 mL(或使用96孔板的孔,每孔200 µL)洗涤细胞(组分E)洗涤两次。 用所需量的洗涤缓冲液重悬细胞。 注意:TF3-DEVD-FMK和Annexin V-iFluor 488 是荧光的,因此重要的是洗净任何未结合的试剂以消除背景。 对于分离的细胞,应将细胞浓度调整为每个酶标仪孔,2-5 X 105细胞/ 100 µL等分试样。

6.通过荧光显微镜,流式细胞仪或荧光酶标仪检测荧光强度,对于TF3-DEVD-FMK,Ex / Em = 550/595 nm;对于Annexin V-iFluor 488 ,490/525;对于Hoechst染色,350/461 nm;碘化丙锭为535/635。
对于流式细胞仪:使用膜联蛋白V-iFluor 488 的FL1通道,用于TF3-DEVD-FMK的FL2通道来检测荧光强度。

对于荧光显微镜:将100 µL细胞悬液放入黑色96孔板的每个孔中。 在荧光显微镜下观察细胞,使用TRITC通道用于TF3-DEVD-FMK,FITC通道用于Annexin V-iFluor 488 (TRITC通道用于碘化丙啶染色,DAPI通道用于Hoechst染色)。

对于荧光酶标仪:将100 µL细胞悬液放入黑色96孔板的每个孔中。 使用荧光酶标仪在Ex / Em = 490/525 nm(截止= 515 nm)或550/595 nm(截止= 570 nn)的Ex / Em = 490/525 nm(截止= 515 nm)处检测荧光强度(底部读取模式)适用于TF3-DEVD-FMK。注意:如果需要平衡细胞浓度,请调整诱导细胞的悬浮液体积,使其接近非诱导细胞的细胞密度。如果细胞治疗不会导致受刺激的细胞数量急剧减少,则此调整步骤是可选的。

 

参考文献

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