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iFluor 555琥珀酰亚胺酯

英文名称:iFluor® 555 succinimidyl ester
产品参数
Ex (nm)557Em (nm)570
分子量1125.26溶剂DMSO
存储条件在零下15度以下保存, 避免光照
产品概述

iFluor 555琥珀酰亚胺酯是iFluor系列荧光标记染料之一,可以覆盖整个可见光谱。所有iFluor 染料都具有优异的水溶性,它们的亲水性使有机溶剂的使用极小化。与常规的染料(如FITC,TRITC,Texas Red ,Cy3 ,Cy5和Cy7)相比,iFluor 染料具有更好的标记性能。一些iFluor 染料在某些抗体上明显优于Alexa Fluor 标记染料。它们是用于标记蛋白质和核酸的极便宜的荧光染料(替代Alexa Fluor 染料)。每种iFluor染料的开发都与特定的Alexa Fluor 或其他标记染料(如DyLight 染料)的光谱特性相匹配。

琥珀酰亚胺基(NHS)酯被证明是用于胺修饰的试剂,因为形成的酰胺键基本上与天然肽键相同并且稳定。这些试剂通常是稳定的并且与脂族胺显示出良好的反应性和选择性。当琥珀酰亚胺酯化合物用于缀合反应时,需要考虑的因素很少:1.溶剂:在大多数情况下,活性染料应溶于无水二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)中。 2.反应pH:胺与琥珀酰亚胺酯的标记反应强烈依赖于pH。胺反应性试剂与非质子化脂族胺基团反应,包括蛋白质的末端胺和赖氨酸的β-氨基。因此,胺酰化反应通常在pH 7.5以上进行。通过琥珀酰亚胺酯进行的蛋白质修饰通常可以在pH 8.5-9.5下进行。 3.反应缓冲液:使用胺反应试剂时,必须避免使用含有游离胺(如Tris和甘氨酸)和硫醇化合物的缓冲液。广泛用于蛋白质沉淀的铵盐(例如硫酸铵和乙酸铵)也必须在进行染料缀合之前除去(例如通过透析)。 4.反应温度:大多数缀合在室温下进行。特定标记反应可能需要升高或降低的温度。iFluor系列染料是AF系列染料的替代品。

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实验方案

染色样本分析

操作步骤

1.准备蛋白质储备溶液(溶液A):

将100μL反应缓冲液(如1 M碳酸钠溶液或1 M磷酸盐缓冲液,pH~9.0)与900μL目标蛋白溶液(如抗体,蛋白质浓度> 2 mg / ml,如果可能)混合至100μL,再加入1 mL蛋白质标记原液。

注1:蛋白质溶液(溶液A)的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0,则使用1M碳酸氢钠溶液或1M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH调节至8.0-9.0的范围。

注2:蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中,则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析,以除去广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐(例如硫酸铵和乙酸铵)。

注3:不纯的抗体、稳定的牛血清蛋白(BSA)抗体或明胶不会被很好的标记。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳汞,以获得标记结果。

注4:如果蛋白质浓度低于2 mg / mL,则结合效率会显着降低。为获得标记效率,建议终蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。

 

2.准备染料储备溶液(溶液B):

将无水DMSO加入到iFluor 染料SE小瓶中以制备10-20mM储备溶液。 通过移液或涡旋混合均匀。

注意:在开始缀合前准备染料储备溶液(溶液B),及时使用。 染料储备溶液的长期储存可降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存两周,避光保存。 避免冻融循环。

 

3.确定染料/蛋白质比例(可选):

注意:每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例,这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能影响其结合亲和力,而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。我们建议您通过使用连续不同量的标记染料溶液重复步骤4和5来实验确定染料/蛋白质比率。通常,对于大多数染料 - 蛋白质缀合物,推荐使用4-6种染料/蛋白质。

3.1使用10:1摩尔比的溶液B(染料)/溶液A(蛋白质)作为起始点:将5μl染料储备溶液(溶液B,假设染料储备溶液为10 mM)加入到样品瓶中。蛋白质溶液(95μl溶液A)有效摇动。假设蛋白质浓度为10mg / mL并且蛋白质的分子量为~200KD,蛋白质的浓度为~0.05mM。

注意:蛋白质溶液中DMSO的浓度应<10%。

3.2运行缀合反应(参见下面的步骤4)。

3.3重复#3.2,溶液B /溶液A的摩尔比为5:1;分别为15:1和20:1。

3.4使用预制的旋转柱纯化所需的缀合物。

3.5计算上述4种结合物的染料/蛋白质比(DOS)。

3.6检测上述4种结合物,确定的染料/蛋白质比例,以扩大标记反应。

 

4.运行结合反应:

4.1有效加入适量的染料储备溶液(溶液B)到蛋白质溶液(溶液A)的小瓶中晃动。

注意:溶液B /溶液的摩尔比由步骤3.6确定。如果跳过步骤3,我们建议使用10:1溶液B(染料)/溶液A(蛋白质)的摩尔比。

4.2继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。

 

5.纯化缀合物

以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料 - 蛋白质缀合物的实例。

5.1按照制造说明准备Sephadex G-25色谱柱。

5.2将反应混合物(直接从步骤4)加载到Sephadex G-25柱的顶部。

5.3样品在顶部树脂表面下方运行时立即加入PBS(pH 7.2-7.4)。

5.4向所需样品中加入更多PBS(pH 7.2-7.4)以完成色谱柱纯化。

注1:立即使用时,染料 - 蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释,并等分多次使用。

注2:对于长期储存,染料 - 蛋白质缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

 

图示

图1.将HeLa细胞与小鼠抗微管蛋白,然后分别与AAT的iFluorTM 555山羊抗小鼠IgG偶联物(红色,右侧)和山羊抗小鼠IgG与AlexaFluor®555偶联(红色,左侧)一起孵育。 细胞核用Hoechst 33342(Blue,Cat#17530)染色。

图2. HeLa细胞用小鼠抗微管蛋白染色,然后用iFluor TM 555山羊抗小鼠IgG(H + L)(红色)染色;肌动蛋白丝用Phalloidin-iFluor TM 488偶联物(绿色)染色;细胞核用DAPI(蓝色)染色。

 

参考文献

Deep Sequencing Analysis of the Eha-Regulated Transcriptome of Edwardsiella tarda Following Acidification
Authors: D Gao, N Liu, Y Li, Y Zhang, G Liu
Journal: Metabolomics (Los Angel) (2017): 2153--0769

Suramin inhibits cullin-RING E3 ubiquitin ligases
Authors: Kenneth Wu, Robert A Chong, Qing Yu, Jin Bai, Donald E Spratt, Kevin Ching, Chan Lee, Haibin Miao, Inger Tappin, Jerard Hurwitz
Journal: Proceedings of the National Academy of Sciences (2016): E2011--E2018

Glycosaminoglycan mimicry by COAM reduces melanoma growth through chemokine induction and function
Authors: Helene Piccard, Nele Berghmans, Eva Korpos, Chris Dillen, Ilse Van Aelst, Sandra Li, Erik Martens, Sandra Liekens, Sam Noppen, Jo Van Damme
Journal: International Journal of Cancer (2012): E425--E436

 

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