iFluor 647琥珀酰亚胺酯
| Ex (nm) | 655 | Em (nm) | 670 |
| 分子量 | 1274.66 | 溶剂 | DMSO |
| 存储条件 | 在零下15度以下保存, 避免光照 |
产品货期
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产品特点
1.具有良好的水溶性： 可以不用有机溶剂进行偶联，在储存期间不易沉淀；
2.光稳定性良好：光稳定性表现良好，可适配长时间图像捕捉实验场景；
3.pH值不敏感：宽 pH 区间内可维持稳定荧光强度；
适用范围
主要用于标记蛋白或抗体
产品介绍
AAT Bioquest的iFluor®染料专为标记蛋白质（尤其是抗体）而优化。这些染料亮度高、光稳定性好，且在蛋白质上的淬灭效应极低。它们能被荧光仪器的主要激光谱线（如350、405、488、555和633 nm）有效激发。
iFluor® 647系列的光谱特性与Cy5®基本一致。iFluor® 647试剂具有高荧光强度和良好的光稳定性。其荧光强度在pH 3至11范围内不受pH值影响。iFluor® 647 SE具有较好的稳定性，并且对蛋白质氨基表现出良好的反应性和选择性。是与蛋白或抗体偶联的常用工具。
NHS 酯可用于标记蛋白、胺修饰的寡核苷酸和其他含胺分子的伯胺 (R-NH2)。
溶液配制
除非另有说明，所有未使用的储备液应在制备后分装，在 -20°C 下储存避免反复冻融
1.准备蛋白质储备溶液（溶液A）：
将 100 µL 反应缓冲液（例如，pH 值约为 8.5 至 9.0 的 1 M 碳酸氢钠溶液或 1 M 磷酸盐缓冲液）与 900 µL 目标蛋白溶液（例如，抗体、蛋白质浓度 > 2 mg/mL（如果可能））混合得到 1 mL 蛋白质标记储备液。
注1：蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0，则使用1M碳酸氢钠溶液或1M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH调节至8.0-9.0的范围。
注2：蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析，除去蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）。
注3：不纯的抗体、稳定的牛血清蛋白（BSA）抗体或明胶不会被很好的标记。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳汞，获得好的标记结果。
注4：如果蛋白质浓度低于2 mg / mL，标记效率会显着降低。为获得合适标记效率，建议蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。
2.准备染料储备溶液（溶液B）：
将无水DMSO加入到iFluor 647 SE小瓶中制备10mM储备溶液。 通过移液或涡旋混合均匀。
注意：在开始缀合前准备染料储备溶液（溶液B），立即使用。 染料储备溶液的长期储存会降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存两周，避光保存。 避免反复冻融。
样本实验方案
（本方案适用 Goat anti-mouse IgG 和iFluor 647 SE的共轭，每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能影响其结合亲和力，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。）
进行偶联反应：
1.使用10：1摩尔比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）作为起始点：将5μl染料储备溶液（溶液B，假设染料储备溶液为10 mM）加入到样品瓶中。蛋白质溶液（95μl溶液A）有效摇动。假设蛋白质浓度为10mg / mL，蛋白质的分子量为~200KD，蛋白质的浓度为~0.05mM。
注意：建议使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比为10:1。如果太少或太高，可以尝试5:1、15:1和20:1来确定合适的染料/蛋白质比。
2.在室温下继续旋转或摇动反应混合物30-60分钟
纯化偶联
（以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料蛋白偶联物的一个例子）
1.按照产品说明准备Sephadex G-25柱。
2.将“进行偶联反应”步骤中的反应混合物装入Sephadex G-25柱的顶部。
3.当样品刚低于顶部树脂表面时，立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。
4.向样品中加入更多的PBS（pH 7.2-7.4）完成柱子纯化。将含有目标染料-蛋白质缀合物的组分合并。
注意：如果需要立即使用，染料-蛋白质缀合物物需要用染色缓冲液稀释，并分装。
注意：为了长期储存，染料蛋白缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。
试剂应用文献
