ReadiCleave iFluor 546 AML-NHS 酯

许多生物分子可以很容易地用荧光标签进行标记，用于荧光成像和流式细胞术分析。然而，大多数现有的荧光标签用于标记生物靶标，添加的荧光标签无法从这些靶标上切割下来用于进一步的下游分析，例如质谱分析或其他检测。 AAT Bioquest 的 ReadiCleave 探针能够将荧光标签与生物靶标结合，需要时可以从生物靶标上去除添加的荧光标签。 ReadiCleave iFluor 546 AML 包含一个叠氮甲基探针，可以用 TCEP 切割以从目标分子中去除 iFluor 546 荧光团。可以通过添加 10-100 mM TCEP 溶液 (pH 7.5) 并在 65°C 下孵育 1-5 分钟来进行裂解。 iFluor 546 是 Alexa Fluor® 546 的卓越替代品。 iFluor 546 和 Alexa Fluor® 546 具有非常相似的光谱特性。

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样品分析方案

储备溶液配制

1. 蛋白质原液（溶液 A）
将 100 µL 反应缓冲液（例如，1 M 碳酸钠溶液或 1 M 磷酸盐缓冲液，pH ~ 9.0）与 900 µL 目标蛋白溶液（例如抗体，如果可能，蛋白质浓度 >2 mg/mL）混合，得到 1 mL 蛋白质标记原液。
注意蛋白质溶液（溶液 A）的 pH 值应为 8.5 ± 0.5。如果蛋白质溶液的 pH 值低于 8.0，则使用 1 M 碳酸氢钠溶液或 1 M pH 9.0 磷酸盐缓冲液将 pH 值调整到 8.0-9.0 的范围内。
注意 蛋白质应溶于 1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，pH 7.2-7.4。如果蛋白质溶解在 Tris 或甘氨酸缓冲液中，则必须用 1X PBS，pH 7.2-7.4 进行透析，以去除用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（如硫酸铵和醋酸铵）。
注意 如果蛋白质浓度低于 2 mg/mL，缀合效率会明显降低。为获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为 2-10 mg/mL。

 

2. ReadiCleave iFluor 546 AML-NHS 酯储备溶液（溶液 B）
将无水 DMSO 添加到 ReadiCleave iFluor 546 AML-NHS 酯小瓶中，制成 10 mM 储备溶液。 通过移液或涡旋混合均匀。
注意 在开始偶联之前准备染料储备溶液（溶液 B），并及时使用。 染料原液的长期储存可能会降低染料活性。 溶液 B 在避光和防潮的情况下可以在冰箱中储存两周。 避免冻融循环。

 

操作步骤

该标记方案是为山羊抗小鼠 IgG 与 ReadiCleave iFluor 546 AML-NHS 酯的偶联而开发的。您可能需要进一步优化您的特定蛋白质。 注意 每种蛋白质需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的特性。蛋白质的过度标记会对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。

 

1.进行缀合反应
使用 10:1 的溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）的摩尔比作为起点：将 5 μL 的染料储备溶液（溶液 B，假设染料库存溶液为 10 mM）在有效摇动下倒入蛋白质溶液（95 µL 溶液 A）小瓶中。 假设蛋白质浓度为 10 mg/mL 且蛋白质的分子量为 ~200KD，则蛋白质的浓度为 ~0.05 mM。
注意 我们建议使用 10:1 摩尔比的溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）。 如果太低或太高，分别确定最佳染料/蛋白质比例为 5:1、15:1 和 20:1。

2.在室温下继续旋转或摇动反应混合物 30-60 分钟。

纯化结合
以下方案是使用 Sephadex G-25 柱进行染料-蛋白质缀合物纯化的示例。
1.根据说明准备 Sephadex G-25 柱。
2.将反应混合物（来自“进行缀合反应”）加载到 Sephadex G-25 列的顶部。
3.样品刚好在顶部树脂表面下方运行时，立即添加 PBS (pH 7.2-7.4)。
4.向所需样品中添加更多 PBS (pH 7.2-7.4) 以完成柱纯化。 结合含有所需染料-蛋白质缀合物的组分。
注意 要立即使用，染料-蛋白质缀合物需要用染色缓冲液稀释，并分装多次使用。
注意 对于长期储存，染料-蛋白质缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

 

数据分析

1.表征所需的染料-蛋白质缀合物
取代度 (DOS) 是表征染料标记蛋白质的最重要因素。 较低 DOS 的蛋白质通常具有较弱的荧光强度，但较高 DOS 的蛋白质（例如 DOS > 6）也往往具有较低的荧光强度。 大多数抗体的最佳 DOS 建议在 2 到 10 之间，具体取决于染料和蛋白质的特性。为了有效标记，应控制取代度，使 6-8 摩尔 ReadiCleave iFluor 546 AML-NHS 酯与 1 摩尔抗体相配。 以下步骤用于确定 ReadiCleave iFluor 546 AML-NHS 酯标记蛋白质的 DOS。

2.吸收检测
要检测染料-蛋白质缀合物的吸收光谱，建议将样品浓度保持在 1-10 µM 的范围内，具体取决于染料的消光系数。

读取 280 nm 处的 OD（吸光度）和染料最大吸光度（对于 ReadiCleave iFluor 546 AML-NHS 酯染料，ƛmax = 541 nm）
对于大多数分光光度计，样品（来自色谱柱馏分）需要用去离子水稀释，以便 OD 值在 0.1 到 0.9 的范围内。 OD（吸光度）在 280 nm 是蛋白质的最大吸收，而 541 nm 是 ReadiCleave iFluor 546 AML-NHS 酯的最大吸收。 要获得准确的 DOS，请确保缀合物中不含非结合染料。

3.计算DOS

您可以通过点击链接使用我们的工具计算DOS计算

 

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