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荧光标记染料 RuFluor 琥珀酰亚胺酯

英文名称:RuFluor™ succinimidyl ester
产品参数
Ex (nm)-Em (nm)-
分子量1915.16溶剂DMSO
存储条件在零下15度以下保存, 避免光照
产品概述

荧光标记染料 RuFluor 琥珀酰亚胺酯是美国AAT Bioquest生产的荧光染料RuFluor 琥珀酰亚胺酯是一种高度水溶性钌配合物,可用于荧光偏振测定,时间分辨免疫测定,ECL免疫测定。像其他琥珀酰亚胺酯化合物一样,RuFluor 琥珀酰亚胺酯在温和条件下在生物分子上标记胺。从RuFluor 琥珀酰亚胺酯获得的生物共轭物在化学和光化学上都是稳定的。电化学发光测定(ECL)是一种基于抗体的测试,旨在检测生物靶标的存在。ECL检测可以检测各种分子量的药物和生物分子。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供优质的荧光标记染料 RuFluor 琥珀酰亚胺酯。 

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实验方案

染色样本分析

操作步骤

1.准备蛋白质储备溶液(溶液A):

将100μL反应缓冲液(如1 M碳酸钠溶液或1 M磷酸盐缓冲液,pH~9.0)与900μL目标蛋白溶液(如抗体,蛋白质浓度> 2 mg / ml,如果可能)混合至100μL给予1 mL蛋白质标记原液。

注1:蛋白质溶液(溶液A)的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0,则使用1M碳酸氢钠溶液或1M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH调节至8.0-9.0的范围。

注2:蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中,则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析,以除去广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐(例如硫酸铵和乙酸铵)。

注3:用牛血清白蛋白(BSA)或明胶稳定的不纯抗体或抗体不能很好标记。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳汞,以获得标记结果。

注4:如果蛋白质浓度低于2 mg / mL,则结合效率会显着降低。为获得标记效率,建议极终蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。

 

2.准备染料储备溶液(溶液B):

将无水DMSO加入到iFluor 染料SE小瓶中以制备10-20mM储备溶液。 通过移液或涡旋混合均匀。

注意:在开始缀合前准备染料储备溶液(溶液B)。 及时使用。 染料储备溶液的长期储存可降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存两周,避光保存。 避免冻融循环。

 

3.确定染料/蛋白质比例(可选):

注意:每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例,这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能不利地影响其结合亲和力,而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。我们建议您通过使用连续不同量的标记染料溶液重复步骤4和5来实验确定染料/蛋白质比率。通常,对于大多数染料 - 蛋白质缀合物,推荐使用4-6种染料/蛋白质。

3.1使用10:1摩尔比的溶液B(染料)/溶液A(蛋白质)作为起始点:将5μl染料储备溶液(溶液B,假设染料储备溶液为10 mM)加入到样品瓶中。蛋白质溶液(95μl溶液A)有效摇动。假设蛋白质浓度为10mg / mL并且蛋白质的分子量为~200KD,蛋白质的浓度为~0.05mM。

注意:蛋白质溶液中DMSO的浓度应<10%。

3.2运行缀合反应(参见下面的步骤4)。

3.3重复#3.2,溶液B /溶液A的摩尔比为5:1;分别为15:1和20:1。

3.4使用预制的旋转柱纯化所需的缀合物。

3.5计算上述4种结合物的染料/蛋白质比(DOS)(见说明书)。

3.6运行上述4种结合物的功能测试,确定的染料/蛋白质比例,以扩大标记反应。

 

4.运行结合反应:

4.1有效加入适量的染料储备溶液(溶液B)到蛋白质溶液(溶液A)的小瓶中晃动。

注意:溶液B /溶液的摩尔比由步骤3.6确定。如果跳过步骤3,我们建议使用10:1溶液B(染料)/溶液A(蛋白质)的摩尔比。

4.2继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。

 

5.纯化缀合物

以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料 - 蛋白质缀合物的实例。

5.1按照制造说明准备Sephadex G-25色谱柱。

5.2将反应混合物(直接从步骤4)加载到Sephadex G-25柱的顶部。

5.3样品在顶部树脂表面下方运行时立即加入PBS(pH 7.2-7.4)。

5.4向所需样品中加入更多PBS(pH 7.2-7.4)以完成色谱柱纯化。 合并含有所需染料 - 蛋白质缀合物的级分。

注1:立即使用时,染料 - 蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释,并等分多次使用。

注2:对于长期储存,染料 - 蛋白质缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥

 

参考文献

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