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Screen Quest cAMP检测试剂盒*荧光ELISA法*

英文名称:Screen Quest™ Fluorimetric ELISA cAMP Assay Kit
产品参数
Ex (nm)571Em (nm)584
分子量-溶剂-
存储条件-
产品概述

Screen Quest 荧光ELISA cAMP分析试剂盒提供了一种优化的分析方法,用于检测G蛋白偶联受体系统中腺苷酸环化酶的。该测定基于HRP标记的cAMP与未标记的cAMP之间固定数目的抗体结合位点的竞争。通过未标记的游离cAMP将HRP-cAMP从HRP-cAMP /抗cAMP抗体复合物中置换出来。在不存在cAMP的情况下,HRP-cAMP偶联物仅与抗cAMP抗体结合。然而,测试样品中未标记的游离cAMP与HRP-cAMP抗体偶联物竞争抗cAMP抗体,因此抑制了HRP-cAMP与抗cAMP抗体的结合。我们的Screen Quest 荧光cAMP分析试剂盒提供了检测腺苷酸环化酶活性的灵敏方法。与其他商用ELISA cAMP分析试剂盒相比,它繁琐的乙酰化步骤。该试剂盒使用Amplite Red作为荧光HRP底物来定量HRP活性。形成的荧光产物与HRP-cAMP偶联物的活性成比例。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供优质的Screen Quest cAMP检测试剂盒。

 

适用仪器


荧光酶标仪  
Ex: 540nm
Em: 590nm
cutoff: 570nm
推荐孔板: 纯黑色孔板(试剂盒自带,组分H)
实验方案

样品实验方案

简要概述

  1. 准备样品
  2. 将75 µL /孔的cAMP标准品或测试样品添加到抗cAMP的96孔板中
  3. 在室温下孵育5-10分钟
  4. 加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP偶联物
  5. 在室温下孵育2小时
  6. 用200 µL /孔的洗涤缓冲液洗涤4次
  7. 添加100 µL /孔的Amplite Red
  8. 在室温下孵育15至60分钟
  9. 检测Ex / Em = 540/590 nm时的荧光增加

 

溶液配制

储备溶液配制

1. cAMP储备溶液(100 µM):将1 mL测定缓冲液(组分B)添加到cAMP标准品(组分A)的小瓶中。 注意:应将未使用的cAMP储备溶液(100 µM)等分并保存在-20℃下。

2. HRP-cAMP偶联物原液(50X):将55 µL(#36373)或550 µL(#36374)的测定缓冲液(组分B)添加到HRP-cAMP偶联物(组分C)的小瓶中。 注意:未使用的50X HRP-cAMP偶联物原液应分为一次性使用的等分试样,并在-20℃下保存。

3.洗涤液(1倍):将1 mL的10X洗涤溶液(组分D)添加到9 mL蒸馏水中。

4. Amplite Red储备液(200X):将50 µL(#36373)或500 µL(#36374)的DMSO加入到Amplite Red(组分G)的小瓶中。 注意:0.5 µL 200X Amplite Red储备液足以用于一个测定点。 应将未使用的再生原液分装并储存在-20℃。

 

工作溶液配制

1. HRP-cAMP工作溶液:在使用前,用测定缓冲液(组分B)以1:50稀释,使其具有1X HRP-cAMP偶联物工作溶液。 存放在冰箱或4°C下。 注意:25 µL 1X HRP-cAMP偶联物工作溶液足以用于一个测定点; 准备适当的体积,仅供一次性使用。

2. Amplite Red工作溶液:向10 mL底物缓冲液(组分I)中加入50 µL Amplite Red储备溶液(200X)和11.5 µL 3%H2O2(组分F)注意:Amplite Red工作溶液不稳定,请立即使用。

 

实验步骤

1.准备样品

1.1根据需要处理细胞:
以下是用Forskolin处理的Hela细胞以96孔板诱导cAMP的示例:吸出细胞生长培养基,在Hanks中加入100 µL /孔100μM Forskolin和20 mM Hepes缓冲液(HHBS),在5%CO2,37°C恒温箱,放置15分钟。孵育后吸出细胞溶液,加入100 µL /孔的细胞裂解缓冲液(组分E),然后在室温下另外孵育10分钟。该细胞裂解液可以直接测定,也可以在测定缓冲液(组分B)中稀释后测定。注意:应单独评估每个细胞系,以确定细胞密度。细胞可以在实验的前或实验当天接种,具体取决于细胞类型和/或受试化合物的作用。

1.2组织样本:
由于组织中环状核苷酸的快速代谢,重要的是在收集后快速冷冻组织(例如,使用液氮)。称重冷冻的组织,并添加10-20 µL / mg细胞裂解缓冲液。在冰箱均质样品。高速旋转5分钟并收集上清液。上清液可以直接测定。

1.3尿液,血浆和培养基样品:
尿液和血浆可以直接在1X裂解缓冲液中以1:200至1:1000的稀释度进行测试。也可以在裂解缓冲液中以1:10至1:200的稀释度测试培养基。注意:RPMI介质可能包含> 350 fmol / µL cAMP。

 

2.cAMP测定

2.1所有测定孔均按以下顺序准备:A)cAMP标准品,对照或测试样品; B)HRP-cAMP偶联物。

2.2将75 µL /孔的cAMP稀释标准溶液和测试样品添加到抗cAMP Ab包被的96孔板(组分F)的每个孔中。 我们建议对每个标准品和测试样品重复测定。在室温下孵育5至10分钟。

2.3加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP偶联物工作溶液。 将板放在摇床上,在室温下孵育2小时。

2.4吸出板内容物,并用200 µL /孔的1X洗涤液洗涤4次。

2.5在每个孔中加入100 µL /孔的Amplite Red工作溶液,并在避光的条件下在室温下孵育10分钟至2小时。

2.6通过使用荧光酶标仪(顶部读取模式),检测Ex / Em = 540/590 nm(截止570 nm)处的荧光增加。

 

图示

图1.使用Screen Quest 荧光ELISA cAMP测定试剂盒在带有Gemini酶标仪的黑色96孔板上测量cAMP剂量反应。

 

 

参考文献

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Journal: Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) (2016): 75

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