百萤推荐：用于细胞凋亡的caspase底物及活性检测试剂

本周，百萤生物为大家推荐的是AAT Bioquest研发生产的caspase系列产品。半胱天冬酶（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶或半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶）是一类蛋白酶，其功能与细胞凋亡（程序性细胞死亡），坏死和发烧（炎症）密切相关。它是胞质天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶，其充当细胞凋亡的主要介质。各种受体，例如TNF-α 受体，FasL受体，TLR和死亡受体，以及Bcl-2和凋亡抑制剂（IAP）蛋白家族参与并调节该caspase依赖性凋亡途径。一旦被上游（外部或内部）刺激 ，胱天蛋白酶执行下游蛋白质底物的蛋白水解，引发一系列事件，导致细胞分解，死亡，吞噬作用和细胞碎片的 。AAT Bioquest提供了大量用于实时酶动力学和终点测定形式测量胱天蛋白酶活性的试剂和试剂盒。

半胱天冬酶底物和抑制剂

Caspase底物和抑制剂由两个关键成分组成：Caspase识别序列和信号产生或蛋白酶抑制基序。半胱天冬酶识别序列由对所测量的半胱天冬酶或半胱天冬酶特异的三个或四个氨基酸标记（表2）。半胱天冬酶识别序列的N端通常用乙酰基（Ac）或碳苯甲氧基（Z）基团修饰，以增强膜的通透性。预期的半胱天冬酶将特定的肽序列识别为其酶促切割位点，释放信号产生或抑制基序。发光和荧光半胱天冬酶底物均以相似的方式操作，其中信号或颜色强度与蛋白水解活性成比例。

表1. Caspase底物和抑制剂的caspase活性肽识别序列

表2. Caspase显色底物：半胱天冬酶显色底物包含信号产生基序，例如与半胱天冬酶识别序列连接的高度着色的生色团pNA（对硝基苯胺或4-硝基苯胺）。使用光吸收酶标仪或分光光度计在405 nm处进行比色监测。

表3. 荧光Caspase底物：荧光半胱天冬酶底物的结构包含与半胱天冬酶识别相关的荧光团，例如7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），7-氨基-4-三氟甲基香豆素（AFC），罗丹明110（R110）或ProRed 620序列。基于R110的半胱天冬酶底物比基于香豆素的半胱天冬酶底物（例如AMC和AFC）更敏感，但由于两步裂解过程，其动态范围更窄。建议将基于R110的caspase底物用于终点测定，而将AMC和AFC caspase底物用于动力学测定。

表4. 可逆和不可逆结合的半胱天冬酶抑制剂：半胱天冬酶抑制剂与半胱天冬酶的活性位点结合并形成可逆或不可逆的连接。通常，半胱天冬酶抑制剂的结构由半胱天冬酶识别序列和诸如醛（-CHO）或氟甲基酮（-FMK）的官能团组成。具有醛官能团的胱天蛋白酶抑制剂是可逆的，而具有FMK的抑制剂是不可逆的。半胱天冬酶底物和抑制剂都具有 小的细胞毒性作用，因此，在研究半胱天冬酶活性时是有用的工具。

半胱天冬酶检测试剂盒

表5. 半胱天冬酶3、7、8和9活性检测试剂盒：Cell Meter 半胱天冬酶活性测定试剂盒提供了一种强大而便捷的方法来测量活细胞中的半胱天冬酶活性。这些检测法利用含有识别位点的可渗透细胞的底物来检测Caspase3和7，Caspase8或Caspase9的活性，以及​​用于同时检测所有Caspase的多重测定。半胱天冬酶识别序列的缀合抑制了荧光团或生色团产生可量化信号的能力。在合适活化的半胱天冬酶的存在下，将荧光团或发色团从识别序列上切割下来，并自由地产生检测细胞凋亡的明亮的荧光或颜色信号。

表6. 基于溶液的半胱天冬酶3和7活性检测试剂盒。

表7. 半胱天冬酶1、2、3 / 7、6、8、9、10和13结合检测试剂盒。