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百萤实验:TF/TQ染料标记MMP和酪蛋白的肽序列及结果

材料和方法


所有肽均采用美国肽公司标准FMOC化学合成。一些TF肽是用FMOC-Lys(TF)-OH、FMOC-Asp(TF)-OH或FMOC-Glu(TF)-OH氨基酸制备的。在肽的标记中,用TF-NHS酯标记赖氨酸残基的N端氨基或ε-氨基。用TF马来酰亚胺或碘代乙酰胺标记巯基半胱氨酸残基。

TF1,TF2,TF3,TF4,TF5,TF6,TF7和TF8的酸、马来酰亚胺和NHS酯形式,以及FMOC-Lys(TF2-Boc)-OHFMOC-Lys(TF3)-OHFMOC-Asp(TF3)-OHFMOC-Glu(TF3)-OH等均可从百萤生物获得。

所有的酶分析都是用从Sigma,R&D Systems,EMD Chemicals购买的纯化酶完成的。使用用日立U-3010拍摄了吸收光谱,终点荧光分析在BMG NovoStar或Gemini SpectraMax(分子设备)上进行,酶动力学分析在FlexStation分子设备上进行)。

 

Tide Fluor (TF)染料的光谱特性


我们的TF系列荧光标记染料覆盖了整个可见光谱,具有非常高的标记效率。例如,TF2的光谱特性与AF 488、FAM和FITC基本相同。在生理条件下或细胞内,它比荧光素亮3倍,耐光性高4倍。TF染料具有对pH4~pH10的pH波动不敏感的荧光,而FAM和FITC的荧光强度在同一范围内强烈依赖于pH值。

TF 染料 Ex(nm) Em(nm) 可替代
TF1 353 nm 442 nm AF350, AMCA, EDANS
TF2 498 nm 520 nm AF488; DL488, FITC, FAM, Cy2
TF3 560 nm 575 nm AF546, AF555, Cy3, DL549, TAMRA
TF4 585 nm 605 nm AF594, DL594, Texas Red®, ROX
TF5 650 nm 670 nm AF633, AF647, DL633, DL649, Cy5
TF6 685 nm 700 nm AF680, DL680, Cy5.5
TF7 755 nm 780 nm AF750, DL750, Cy7
TF8 785 nm 800 nm DL800, IRDye CW800

 

使用TF标记的FRET底物检测基质金属蛋白酶(MMP)活性


基质金属蛋白酶(MMPs)参与细胞外基质成分的降解,在细胞凋亡、胚胎发育、生殖组织重塑和修复中起重要作用。 百萤为大家筛选了以下基于TF的FRET底物,以检测MMP活性。

#Sub 肽序列 Ex Em
1 TQ2-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaDab(5-FAM)-Ala-Lys-NH2 492 nm 514 nm
2 TQ2-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaDab(TF2)-Ala-Lys-NH2 495 nm 520 nm
3 TQ3-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(TF3)-Ala-Lys-NH2 560 nm 575 nm
4 TQ4-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(TF4)-Ala-Lys-NH2 585 nm 605 nm
5 TQ5-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(FT5)-Ala-Lys-NH2 650 nm 670 nm
6 TQ6-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(FT6)-Ala-Lys-NH2 685 nm 700 nm
7 TQ7-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(TF7)-Ala-Lys-NH2 755 nm 780 nm
8 TQ8-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(TF8)-Ala-Lys-NH2 785 nm 800 nm

 

MMP活性的检测(续)

图1.以TF为基础的MMP底物与MMP-1(50units/ml)在室温下孵育15分钟。所有基质在5 uM的温度下使用,使用Sub#2的反应速度设定为100%。用上表中分别列出的激发波长和发射波长测量荧光强度。

 

用TF标记酪蛋白底物检测通用蛋白酶活性


对各种蛋白酶活性的检测已成为许多生物实验室的常规任务。TF染料标记的酪蛋白缀合物被证明是广泛的蛋白酶的通用底物。在完整的底物中,酪蛋白被TF染料大量标记,导致了荧光猝灭。蛋白酶催化水解减轻了它的淬灭效应,产生荧光性很强的TF染料标记的肽段。TF染料标记肽荧光强度的增加与蛋白酶活性成正比。

#Sub 肽底物 Ex/Em 相对Kcat/Km
1 TF1-Casein (~6 Dyes/Casein) 492/514 nm 98%
2 TF2-Casein (~6 Dyes/Casein) 495/520 nm 92%
3 TF3-Casein (~6 Dyes/Casein) 560/575 nm 100%
4 TF4-Casein (~5 Dyes/Casein) 585/605 nm 73%
5 TF5-Casein (~5 Dyes/Casein) 650/670 nm 81%
6 TF6-Casein (~4 Dyes/Casein) 685/700 nm 76%
7 TF7-Casein (~4 Dyes/Casein) 755/780 nm 56%
8 TF8-Casein (~4 Dyes/Casein) 785/800 nm 43%

图2. #3底物胰蛋白酶的蛋白水解裂解图。 在室温下将3号底物与胰蛋白酶一起孵育。对照孔仅具有蛋白酶底物,而没有胰蛋白酶。 使用FlexStation从时间0(添加胰蛋白酶时)开始检测荧光信号。


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