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使用iFluor 染料琥珀酰亚胺酯标记蛋白质

iFluor™染料是一系列出色的荧光标记染料,可跨越整个可见光谱。所有iFluor™染料均具有出色的水溶性。它们的亲水性可最大程度地减少有机溶剂的使用。与经典的荧光标记染料(如FITC,TRITC,TexasRed®,Cy3®,Cy5®和Cy7®)相比,iFluor™染料还具有更好的标记性能。我们的某些iFluor™染料在某些抗体上的性能明显优于AlexaFluor®标记染料。它们是用于标记蛋白质和核酸的优秀的荧光染料。每种iFluor™染料都经过开发以匹配特定AlexaFluor®或其他标记染料(例如DyLight™染料)的光谱特性。

事实证明,琥珀酰亚胺(NHS)酯是用于胺修饰的最佳试剂,因为所形成的酰胺键与天然肽键基本相同且稳定。这些试剂通常是稳定的,并且与脂族胺显示出良好的反应性和选择性。将琥珀酰亚胺酯化合物用于共轭反应时,需要考虑的因素很少:1)溶剂:在大多数情况下,应将活性染料溶于无水二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)中。2)反应pH:胺与琥珀酰亚胺酯的标记反应强烈依赖于pH。胺反应试剂与非质子化的脂肪胺基团反应,包括蛋白质的末端胺基和赖氨酸的e-氨基。因此,胺酰化反应通常在pH 7.5以上进行。通过琥珀酰亚胺酯进行的蛋白质修饰通常可以在pH 8.5-9.5下进行。3)反应缓冲液:当使用与胺反应的试剂时,必须避免使用含有游离胺(例如Tris和甘氨酸和硫醇化合物)的缓冲液。广泛用于蛋白质沉淀的铵盐(例如硫酸铵和乙酸铵)在进行染料偶联之前也必须除去(例如通过透析)。4)反应温度:大多数偶联是在室温下完成的。但是,对于特定的标记反应,可能需要升高或降低温度。

图1.化学偶联至伯胺的NHS酯反应方案。


储存及处理

iFluor™染料应在<-15℃下保存,并避光和防潮。重组后的iFluor™染料的DMSO储备溶液可以在<-15℃下保存最大不可超过两周。蛋白质偶联物应在载体蛋白(例如0.1%牛血清白蛋白)存在下以> 0.5 mg / mL的浓度存储。当在2 mM叠氮化钠存在的情况下避光保存时,缀合物溶液可以在4°C下保存两个月而不会发生明显变化。为了更长的存储时间,可以将蛋白结合物冻干或分成单份使用,并保存在≤–60°C下,并避光。

样品标记方案

该标记方案是针对山羊抗小鼠IgG与iFluor™647 SE的缀合物而开发的,仅用于实验参考。实际应根据您的特定需求进行修改。

  1. 制备蛋白质储备溶液(溶液A)
    1. 将100 µL反应缓冲液(例如1 M碳酸钠溶液或pH值为9.0的1 M磷酸盐缓冲液)与900 µL目标蛋白溶液(例如抗体,如果可能,蛋白浓度> 2 mg / mL)混合,得到1 mL蛋白质标记储备液。

      注意1:蛋白质溶液(溶液A)的pH值应为8.5 ± 0.5。如果蛋白质溶液的pH值低于8.0,请使用1 M碳酸氢钠溶液或1 M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH值调整为8.0-9.0。

      注意2:蛋白质应溶于1X磷酸盐缓冲液(PBS),pH 7.2-7.4。如果将蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中,则必须在pH 7.2-7.4的1X PBS中进行透析,以去除广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐(例如硫酸铵和乙酸铵)。

      注意3:不纯的抗体或用牛血清白蛋白(BSA)或明胶稳定的抗体不会被正确标记。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。叠氮化钠或硫柳汞可以通过透析或离心柱去除,以获得最佳标记效果。

      注意4:如果蛋白质浓度低于2 mg / mL,结合效率会大大降低。为了获得最佳标记效率,建议最终蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。

  2. 制备染料储存溶液(溶液B)
    1. 将无水DMSO加入iFluor™SE染料小瓶中,制成10-20 mM储备液,混合均匀。

      注意1:开始缀合之前,请准备染料储备溶液(溶液B),立即使用。染料储备溶液的长时间储存​​可能会降低染料活性。避开光线和水分,溶液B可以在冰箱中保存两周。避免冻融循环。

  3. 确定最佳染料浓度与蛋白质的比例

    每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例,这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能有害地影响其结合亲和力,而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。我们建议您通过使用一系列不同量的标记染料溶液重复步骤4和5,以实验方式确定最佳的染料/蛋白质比例。通常,大多数染料-蛋白质偶联物建议使用4-6种染料/蛋白质。

    1. 以溶液B(染料)/溶液A(蛋白质)的10:1摩尔比为起点:将5 µL染料储备溶液(溶液B,假定染料储备溶液为10 mM)添加到蛋白质瓶中。溶液(95 µL溶液A)有效摇动。假设蛋白质浓度为10 mg / mL,蛋白质的分子量为〜200KD,则蛋白质的浓度为〜0.05 mM。

      注意1:蛋白质溶液中DMSO的浓度应小于10%。

    2. 运行缀合反应(请参见下面的步骤4)。
    3. 重复步骤3b,溶液B /溶液A的摩尔比为5:1;15:1和20:1。
    4. 使用预制的旋转柱纯化所需的结合物。
    5. 计算上述4种结合物的染料/蛋白质比率(DOS)
    6. 对以上4种结合物进行功能测试,以确定最佳的染料/蛋白质比率,以扩大标记反应的范围。
  4. 进行共轭反应
    1. 在有效摇动下,将适量的染料原液(溶液B)添加到蛋白质溶液(溶液A)的小瓶中。

      注意1:溶液B(染料)/溶液A(蛋白质)的最佳摩尔比由步骤3f确定。如果跳过步骤3,我们建议使用溶液B(染料)/溶液A(蛋白质)的摩尔比为10:1。

    2. 在室温下继续旋转或摇动反应混合物30-60分钟。
  5. 共轭物纯化

    以下方案是使用Sephadex G-25色谱柱纯化染料-蛋白质偶联物的示例。

    1. 根据生产说明准备Sephadex G-25色谱柱。
    2. 将反应混合物(直接来自步骤4)加载到Sephadex G-25色谱柱的顶部。
    3. 一旦样品刚好在顶部树脂表面下方运行,就添加PBS(pH 7.2-7.4)。
    4. 向所需样品中添加更多PBS(pH 7.2-7.4),以完成柱纯化。合并包含所需染料-蛋白质缀合物的级分。

      注意1:要立即使用,染料-蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释,若一次用不完请分装,选择恰当的储存方式保存。

      注意2:为了长期保存,染料-蛋白质结合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

表征所需的染料-蛋白质缀合物

取代度(DOS)是表征染料标记蛋白的最重要因素。较低DOS的蛋白质通常具有较弱的荧光强度,但是较高DOS的蛋白质(例如DOS> 6)也往往具有减弱的荧光。对于大多数抗体,最佳DOS建议在2到10之间,具体取决于染料和蛋白质的特性。为了有效标记,应将取代度控制为对一摩尔抗体具有4-10摩尔iFluor™647 SE。以下步骤用于确定iFluor™647 SE标记的蛋白的DOS。

  1. 测量吸收率:
    1. 要测量染料-蛋白质偶联物的吸收光谱,建议根据染料的消光系数将样品浓度保持在1-10 mM的范围内。
  2. 读取280 nm处的OD(吸光度)和染料最大吸收率(iFluor™647染料的λmax = 649 nm):
    1. 对于大多数分光光度计,样品(来自色谱柱的馏分)需要用去离子水稀释,以使OD值在0.1至0.9的范围内。280 nm处的OD(吸光度)是蛋白质的最大吸收,而649 nm是iFluor™647 SE的最大吸收。要获得准确的DOS,请确保结合物不含非结合物染料。
  3. 使用以下方程式计算DOS:
    1. 计算蛋白质浓度

      [蛋白质] = [(染料的最大吸收量280 OD x 280nm处的CF)] /蛋白质消光系数] x稀释倍数

    2. 计算染料浓度

      [染料] = [最大吸收/染料消光系数时的OD] x稀释系数

    3. 计算标记度:

      DOS = [染料] / [蛋白质] = [ d OD 649 X P ε 280 ] / [250000 X(A 280 - 0.03A 649)]

[染料]是染料的浓度,可以根据Bee-Lambert定律轻松计算:A =ε 染料 CL。[蛋白质]是蛋白质浓度。如果结合效率足够高(优选> 70%),则可以通过重量(添加到反应中)估计该值,或者根据比尔-朗伯定律更准确地计算出:A =ε 蛋白 CL。例如,IgG的ε值为203,000cm -1 M -1。P ε 280在280nm处蛋白质的摩尔消光系数(例如IgG的摩尔消光系数是203000厘米-1中号-1)。CF(280 nm处的染料吸收校正因子)= OD 280 / OD 649对于iFluor™647染料SE = 0.03。250,000 cm -1 M -1是iFluor™647 SE的摩尔消光系数。


附录1. iFluor™荧光标记染料的光谱特性

 Dye  Ext. Coeff. 1  Abs. (nm)  Em. (nm)  FQY 2  CF at 260 nm 3  CF at 280 nm 4
 iFluor™ 350  20,000  346  443  0.95  0.83  0.23
 iFluor™ 405  37,000  402  425  0.91  0.48  0.77
 iFluor™ 430  40,000  433  497  0.78  0.68  0.3
 iFluor™ 450  40,000  449  504  0.82  0.45  0.27
 iFluor™ 488  75,000  491  518  0.9  0.21  0.11
 iFluor™ 514  80,000  511  527  0.83  0.25  0.11
 iFluor™ 532  90,000  536  560  0.68  0.26  0.16
 iFluor™ 546  100,000  541  557  0.67  0.25  0.15
 iFluor™ 555  100,000  552  567  0.64  0.23  0.14
 iFluor™ 568  100,000  568  587  0.57  0.34  0.15
 iFluor™ 594  180,000  594  614  0.53  0.05  0.04
 iFluor™ 610  110,000  605  627  0.85  0.32  0.49
 iFluor™ 633  250,000  638  655  0.29  0.062  0.044
 iFluor™ 647  250,000  649  664  0.25  0.03  0.03
 iFluor™ 660  250,000  662  678  0.26  0.07  0.08
 iFluor™ 680  220,000  684  702  0.23  0.097  0.094
 iFluor™ 700  220,000  685  710  0.23  0.09  0.04
 iFluor™ 710  190,000  712  736  0.14  0.12  0.07
 iFluor™ 750  275,000  749  775  0.12  0.044  0.039
 iFluor™ 790  275,000  782  811  0.13  0.1  0.09
 iFluor™ 800  250,000  801  820  0.11  0.03  0.08
 iFluor™ 810  250,000  811  825  0.05  0.09  0.15
 iFluor™ 820  250,000  822  852  N/A  0.11  0.16
 iFluor™ 860  250,000  854  878  N/A  0.1  0.14