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自带荧光的藻蛋白家族(三)

 

        藻胆蛋白是源自微藻和蓝细菌的光合作用光捕获蛋白家族。这些蛋白质具有共价连接的线性四吡咯基团,称为藻胆素,其在捕获光能中起关键作用。在微藻和蓝细菌中,由这些藻胆素吸收的能量通过荧光共振能量转移(FRET)有效地转移到叶绿素色素用于光合作用反应。

        与化学合成荧光染料相比,藻胆蛋白由于其相对高的荧光量子产率和消光系数而发出强烈的荧光信号。因为它们的荧光不被生物分子猝灭,所以藻胆蛋白可以在许多应用中用作有价值的荧光标签。与生物分子(例如免疫球蛋白,蛋白A或链霉抗生物素蛋白)缀合的藻胆蛋白已经在流式细胞术,荧光激活细胞分选(FACS),组织化学,成像和有限程度的活性氧物种检测中取得了巨大成功。两种主要类型的藻胆蛋白是市售的藻红蛋白(PE)和别藻蓝蛋白(APC)。

 

冻干ReadiUse PE和液体形式PE的标记效率

        ReadiUse PE的标记效率是另一个需要检查的重要因素,因为它直接影响结合物的荧光产量。例如,PE的常见应用是用Cy5修饰它以产生PE / Cy5串联染料。因为猝灭异常强烈的原因导致将Cy5过度标记到PE上将会显著降低荧光产率。

        标记效率可以通过计算标记程度来确定,标记程度是缀合后染料与蛋白质(PE)的摩尔比。使用Cy5缀合反应检测ReadiUse PE 存储在不同的温度(4℃,RT,-20℃和-65℃,2个月)的反应性。ReadiUse PE在100微升水中重构,其最终浓度为10mg/ml。随后制备Cy5,SE(Cat#151)染料加工溶液并将其加入ReadiUse PE溶液中。缀合反应在室温下搅拌进行60分钟。新鲜制备的PE以相同方式与Cy5缀合,并用作阳性对照。

 

图5.冻干的ReadiUse PE和新鲜PE标记效率的比较

 

冻干ReadiUse APC和液体形式APC的标记效率

        使用Cy7缀合反应检测ReadiUse APC的标记效率。ReadiUse APC,存储在不同的温度(4℃,RT,-20℃和-65℃,2个月),ReadiUse APC在100微升水中重构,其最终浓度为10mg/ml。制备Cy7,SE(Cat#170)染料加工溶液并将其加入ReadiUse APC溶液中。缀合反应在室温下搅拌进行60分钟。新鲜制备的APC以相同方式与Cy7缀合,并用作阳性对照。

 

图6. 冻干的ReadiUse APC和新鲜APC标记效率的比较

 

        在HL-60细胞中检测了ReadiUse PE-Cy5串联和ReadiUse APC-Cy7串联的性能。使用Buccutite 快速蛋白质缀合试剂盒(Cat#1315)将ReadiUse PE-Cy5串联和ReadiUse APC-Cy7串联缀合至GXM IgG。随之使用Buccutite 缀合试剂盒用新鲜纯化的PE-Cy5和PE-Cy7串联制备缀合物,并用作阳性对照。结果表明,ReadiUse PE-Cy5和ReadiUse APC-Cy7缀合物在性能上与新鲜纯化的PE-Cy5和APC-Cy7缀合物相当。

图7.比较GXM IgG-PE / Cy5缀合物与ReadiUse PE-Cy5串联和新鲜纯化的PE-Cy5串联的性能。用或不用w6 / 32抗体(1ug / ml)染色HL-60细胞30分钟,然后用GXM IgG-PE / Cy5(10ug / ml)染色30分钟。通过相同的Buccutite 反应制备GXM IgG-PE / Cy5缀合物。

 

图8.  用ReadiUse APC-Cy7串联和新鲜纯化的APC-Cy7串联制备的GXM IgG-APC / Cy7缀合物的性能。用或不用w6 / 32抗体(1ug / ml)染色HL-60细胞30分钟,然后用GXM IgG-APC / Cy7(5ug / ml)染色30分钟。通过相同的Buccutite 反应制备GXM IgG-APC / Cy7缀合物。

结论:

        AAT Bioquest的ReadiUse PE和ReadiUse APC与市售产品相当。我们的冻干藻胆蛋白在不同条件下稳定,如RT,4℃和-20℃和-65℃,不会改变光谱特性,标记效率和性能。此外,ReadiUse PE和ReadiUse APC不含硫酸铵的粉末,不需要任何纯化(例如透析或脱盐),显著缩短了检测时间,提高了质量的一致性和重组浓度的灵活性,并且还减少了运输成本。

 

产品订购信息

 

表1. ReadiUse PE,ReadiUse APC和ReadiUse 串联染料的产品订购信息

Cat#

产品名称

Ex(nm)

Em(nm)

规格

价格

2500

ReadiUse PE [R-藻红蛋白] *无硫酸铵*

565

575

1毫克

1140

2501

ReadiUse PE [R-藻红蛋白] *无硫酸铵*

565

575

10毫克

5940

2503

ReadiUse CL-APC [交联 - 别藻蓝蛋白] *无硫酸铵*

651

662

1毫克

1140

2504

ReadiUse CL-APC [交联 - 别藻蓝蛋白] *无硫酸铵*

651

662

10毫克

5940

2560

ReadiUse 预活化PE

565

575

1毫克

3540

2561

ReadiUse 预活化APC

651

713

1毫克

3540

2570

ReadiUse 预活化APC-iFluor 700串联

651

713

1毫克

4140

2571

ReadiUse 预活化APC-iFluor 750 Tandem

651

779

1毫克

4140

2577

ReadiUse 预活化PE-iFluor 647 Tandem

565

674

1毫克

4140

2578

ReadiUse 预活化PE-iFluor 750串联

565

779

1毫克

4140

2580

ReadiUse 预活化PE-Cy5串联

565

670

1毫克

4140

2581

ReadiUse 预活化PE-Cy5.5串联

565

700

1毫克

4140

2582

ReadiUse 预活化PE-Cy7 Tandem

565

780

1毫克

4140

2583

ReadiUse 预活化PE-Texas Red Tandem

565

600

1毫克

4140

2584

ReadiUse 预活化PE-iFluor 594 Tandem

565

600

1毫克

4140

2586

ReadiUse 预活化APC-Cy5.5串联

651

700

1毫克

4140

2587

ReadiUse 预活化APC-Cy7 Tandem

651

780

1毫克

4140

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