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自带荧光的藻蛋白家族(二)

 

        藻胆蛋白是源自微藻和蓝细菌的光合作用光捕获蛋白家族。这些蛋白质具有共价连接的线性四吡咯基团,称为藻胆素,其在捕获光能中起关键作用。在微藻和蓝细菌中,由这些藻胆素吸收的能量通过荧光共振能量转移(FRET)有效地转移到叶绿素色素用于光合作用反应。

        与化学合成荧光染料相比,藻胆蛋白由于其相对高的荧光量子产率和消光系数而发出强烈的荧光信号。因为它们的荧光不被生物分子猝灭,所以藻胆蛋白可以在许多应用中用作有价值的荧光标签。与生物分子(例如免疫球蛋白,蛋白A或链霉抗生物素蛋白)缀合的藻胆蛋白已经在流式细胞术,荧光激活细胞分选(FACS),组织化学,成像和有限程度的活性氧物种检测中取得了巨大成功。两种主要类型的藻胆蛋白是市售的藻红蛋白(PE)和别藻蓝蛋白(APC)。

 

ReadiUse PE和APC

        为了使用PE或APC进行流式细胞术,必须首先将荧光蛋白与抗体缀合。然而,市售的藻胆蛋白浓缩在硫酸铵悬浮液中。虽然两者都表现出良好的长期稳定性,但它们需要繁琐的纯化过程,例如透析,硫酸盐沉淀或凝胶过滤色谱,以在抗体缀合之前除去硫酸铵杂质。一旦纯化,PE和APC必须冷藏,不冷冻,并在一个月内使用,以获得最佳效果。

        AAT Bioquest开发了一种用于冻干纯化的藻胆蛋白的创新技术。我们的ReadiUse 藻胆蛋白系列是不含硫酸铵的冻干粉末。去除这种强沉淀剂消除了纯化过程,并促进PE或APC与抗体和其他蛋白质的快速缀合。以下是使用Buccutite 快速蛋白质交联试剂盒(Cat#1315)的ReadiUse PE(Cat#2500)的方案概述:

  1. 在H2O中重构ReadiUse PE
  2. 用Buccutite缀合激活PE和抗体
  3. 混合Buccutite活化的PE和活化的抗体
  4. 使用脱盐柱净化共轭物

 

比较分析:ReadiUse PEReadiUse APC

        在本研究中,将冻干的ReadiUse PE(Cat#2500)ReadiUse APC(Cat#2503)(AAT Bioquest)分别在各种不同条件下储存。随后,测试各种不同储存条件对悬浮在硫酸铵中的传统藻胆蛋白的性能的影响。测试性能包括(对光谱特性,荧光量子产率和标记效率的比较)。在测试之前,纯化传统的藻胆蛋白以除去硫酸铵。

 

存储条件经过测试

        将ReadiUse PE和ReadiUse APC等分到1mg小瓶中,并在四个不同温度下储存两个月。温度包括:

  • 新鲜 - 悬浮在硫酸铵中的新鲜纯化的藻胆蛋白(在当天制备)
  • L - 4 oC - 冻干粉末,ReadiUse PE和ReadiUse APC储存于2-8 o C
  • L - RT - 冻干粉末,ReadiUsePE和ReadiUse APC在室温下储存
  • L - ( - 20 oC) - 冻干粉末,ReadiUse PE和ReadiUse APC储存在< - 15 o C
  • L - ( - 65 oC) - 冻干粉末,ReadiUse PE和ReadiUse APC储存<-65 o C

 

准备PE和APC

        在测试当天,使用透析纯化硫酸铵溶液中饱和的藻胆蛋白,以除去硫酸铵杂质。从储存中取出ReadiUse PE和ReadiUse APC,并在100μLH2O中重构,最终浓度调为10 mg / mL。

 

ReadiUse PE光谱特性

        在相同的条件和浓度下测量ReadiUse PE和新鲜纯化的PE在PBS中的吸光度和发射光谱。请见表3,表4和图3的光谱比较数据总结。数据表明,ReadiUse PE满足PE的所有规格,非常稳定,可在RT至-65o C下保存约2个月,在激发,发射和量子产率方面变化很小。

 

表3. ReadiUse PE和含硫酸铵的PE的光谱特性比较

PE

Fresh(Purified) 

L-4 oC

L-RT 

L-(-20 oC) 

L-(-65 oC) 

规格 

A565 / A280 

5.83

5.72

5.72

5.76

5.77

> 5.6 

A565 / A498 

1.45

1.45

1.45

1.45

1.45

<1.5 

A620 / A565 

0

0

0.003

0.002

0.002

<0.005 

Em Max 

574nm 

574nm 

574nm 

574nm 

574nm 

  574nm

 

  4.ReadiUse PE和含硫酸铵的PE的量子产率

属性

Fresh(Purified)

L-4 oC

L-RT 

L - ( - 20oC) 

L - ( - 65oC) 

Ex WL 

490nm处 

490nm处 

490nm处 

490nm处 

490nm处 

Em WL 

574nm 

574nm 

574nm 

574nm 

574nm 

相对量子产率 

100%

99.5%

97.8%

100%

99.3%

图3.  冻干(ReadiUse)PE和液体形式PE的比较。比较565至280nm和565至498nm的吸光度比率,并且还用490nm激发测量相同浓度下的相对发射强度,并绘制在图中。

 

ReadiUse APC光谱特性

        在相同的条件和浓度下测量ReadiUse APC和新鲜纯化的APC在PBS中的吸光度和发射光谱。请见表5,表6和图4的光谱比较数据总结。数据表明,ReadiUse APC满足APC的所有规格,非常稳定,可在RT至-65 o C下保存约2个月,在激发,发射和量子产率方面变化很小。

 

 表5.  ReadiUse APC和含硫酸铵的APC的光谱特性比较

APC 

Fresh(Purified)

L-4 oC

L-RT 

L - (-20oC) 

L - (-60oC) 

规格

A651 / A280 

5.18

4.98

4.95

4.62

4.95

> 4.6 

A651 / A620 

1.57

1.53

1.53

1.53

1.53

> 1.5 

EM Max 

661.00纳米 

660.00纳米 

660.00纳米 

660.00纳米 

660.00纳米 

  

 

表6.  ReadiUse APC和含硫酸铵的APC的量子产率

属性

Fresh(Purified)

L-4 oC

L-RT 

L - ( - 20 oC) 

L - ( - 65 oC) 

Ex WL 

630纳米 

630纳米

630纳米

630纳米

630纳米

Em WL 

661.01 nm

660.00纳米

660.00纳米

660.00纳米

660.00纳米

相对量子产率 

100%

98.7%

97%

97%

97%

图4.冻干(ReadiUse)APC和液体形式APC的比较。比较光谱性质,并用630nm激发测量相同浓度下的相对发射强度。

 

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