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Amplite 用于测定NAD和NADH定量的试剂

 

        定量的NAD+及其还原形式NADH的产生或消耗对于监测NAD+/ NADH酶介导的反应或筛选这些反应的调节剂和底物很重要。但是,传统的NAD+和NADH测定分析并非没有他们的注意事项。许多现有方法都是在340nm的紫外波长下的吸收来监测NADH的变化。在该波长下,生物样品和塑料由于光散射和自发荧光而产生干扰。这些干扰大幅度的降低了测定灵敏度,可能需要使用反分析来鉴定干扰检测方法的潜在化合物。此外,在UV范围内进行的分析需要使用昂贵的石英比色皿和微孔板。为了解决这个问题,AAT Bioquest®开发了一系列比色和荧光测定法,用于测定可见光谱(400nm–700nm)中的NAD+和NADH。我们的荧光测定法具有更高的灵敏度,需要使用荧光酶标仪或类似设置。而比色法操作简单,可以使用标准吸光度酶标仪进行读取。 

 

NAD+检测

        虽然市场上有几种测定法可用于量化NADH以及生物样品中NAD + /NADH的总量或比例,但对于NAD +的定量分析几乎没有。由于NAD+的固有特性。当紫外光在259nm处吸收峰值时,NAD+是非荧光的,因此它的其测量不够准确。然而,AAT Bioquest®开发的荧光法NAD +检测试剂盒,使用专有荧光传感器Quest Fluor NAD,专门检测NAD+。我们的试剂在00μL测定体积中可以检测到少至30 nM的NAD+。Quest Fluor NAD探针对NADH几乎没有反应,与NAD+结合后,产生与NAD+浓度成比例的荧光信号。简单的添加-混合-读取方法使该测定适用于96孔或384孔微量滴定板形式的高通量筛选。

 

图1.使用Germini酶标仪(Molecular devices),在96孔黑色/固体底板中用Amplite 荧光NAD+测定试剂盒(货号:15280)测量NAD+剂量响应。A:NAD+标准曲线,在孵育20分钟时可检测到低至30nM的NAD+(n = 3)。B:NAD+和NADH反应的比较。C:在溶液中存在100μMNADH的NAD+标准曲线。从孵育20分钟(n = 3)可以检测到从NADH转化的低至0.3%的NAD+(~300nM)。

 

NADH检测

        NADH(NAD+的还原形式)的检测可以用比色法或荧光法测定。Amplite 比色NADH检测试剂盒采用新型生色传感器,比传统的NADH探针更有优势。与最大吸收在340 nm处的传统探针相比,我们的生色传感器在NADH减少时在460 nm处具有最大吸光度。因为这两个值是成比例的,所以从460nm处的吸光度增加,可以很容易计算在100μL测定体积中少至3μM的NADH的浓度。Amplite 荧光NADH检测试剂盒是一种均相的单试剂加成试验,可在酶循环反应中专门的识别NADH。这种酶循环反应显著提高了检测灵敏度,在100μL的分析体积中仅检测1μm的NADH。

图2.使用NOVOStar酶标仪(BMG Labtech),在96孔黑色板中用Amplite 荧光NADH检测试剂盒(Cat#15261)测量NADH剂量反应。在孵育1小时(n = 3)时,可以检测到低至1μM(100pmol /孔)的NADH,而NAD+没有响应。

 

总NAD+/ NADH和NAD+/ NADH比率测定

        NAD+/ NADH比率(氧化形式和还原形式之间的平衡)是细胞氧化还原状态的重要指标,测量时,可以了解细胞的代谢活动和健康状况。Amplite 比色法和荧光法总NAD+/ NADH和NAD+/ NADH比率检测是一系列均用于灵敏检测总氧化和还原NAD+以及它们在生物样品中的比例。这些测定依赖于酶循环反应系统,其快速地识别具有优异灵敏度的NAD+/ NADH。此外,已经证明荧光测定,由于其光谱特性(在红色可见范围内),减少了生物样品的干扰。对于研究人员而言,这些检测试剂简单方便。在使用之前不需要从样品中纯化NAD+/ NADH,并且每个检测都很容易地适应自动化,无需分离步骤。根据检测格式不同,只需使用460 nm的吸光度酶标仪或Ex/Em = 540/590 nm的荧光酶标仪进行混合读取。

 

图3. Amplite 比色法NAD+/ NADH比率检测试剂盒(货号:15273)用于测量NAD+使用SpectraMax在96孔白色壁/透明底微板/NADH比率®酶标仪(Molecular Devices)中。使用或不使用NAD+提取溶液处理等量的NAD+和NADH混合物15分钟,然后在室温下用提取溶液中和。在460nm读取信号。根据图中所示的吸光度计算NAD+/ NADH比率。

 

图4.使用Gemini酶标仪(Molecular Devices),在96孔黑色板中用Amplite 荧光NAD+/NADH比率测定试剂盒(Cat#15263)测量总NADH /NAD+及其提取物剂量反应。使用或不使用NADH或NAD +提取溶液处理25μL等量的NAD+和NADH15分钟,然后在室温下用提取溶液中和。在加入75μLNADH反应混合物后30分钟,在Ex/Em= 540/590nm处读取信号。从具有NADH反应的那些孔的值中减去空白信号。

 

产品订购信息

货号

产品名称

Ex(nm)

Em(nm)

规格

价格

15280

Amplite 荧光法NAD检测试剂盒*蓝色荧光*

422

466

200Tests

4140

15271

Amplite 比色法NADH检测试剂盒

460

 

400Tests

2940

15261

Amplite 荧光法NADH检测试剂盒*红色荧光*

571

585

400Tests

3540

15258

Amplite 比色法NAD/NADH检测试剂盒

575

 

400Tests

3540

15275

Amplite 比色法NAD/NADH检测试剂盒*增强灵敏度*

460

 

400Tests

3540

15257

Amplite 荧光法NAD/NADH检测试剂盒*红色荧光*

571

585

400Tests

3540

15273

Amplite 比色法NAD/NADH比率分析试剂盒

460

 

250Tests

4140

15263

Amplite 荧光法NAD/NADH比率分析试剂盒*红色荧光*

571

585

250Tests

4140