ELISA 检测传统上在 96 孔微孔板中进行。这些板旨在被动结合和固定抗原，通常通过直接吸附到微孔板表面或间接通过预包被的“捕获”抗体。一旦固定，一抗被引入样品，与抗原形成免疫复合物。一抗可以与酶（如 HRP）共价标记，或者如果一抗用生物素标记，则可以使用酶标记的二抗或链霉亲和素偶联物间接检测自身。检测是通过与合适的底物一起孵育来评估结合酶的活性来实现的。底物的灵敏度和成像设备的兼容性各不相同，在设计 ELISA 时应仔细考虑。
ELISA的三种检测形式
1.直接ELISA
| 直接 ELISA 特点 |
| 应用 |
- 用于评估抗体亲和力和特异性
- 用于检查阻断/抑制相互作用
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| 优点 |
- 简单快速，需要更少的试剂和更少的步骤
- 了二抗的交叉反应
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| 缺点 |
- 抗原固定不是特异性的，导致潜在的高背景干扰
- 一抗必须单独标记，既费时又费钱
- 一抗偶联物的免疫反应性可能受到酶的不利影响
- 灵活性低，因为必须偶联一抗
- 无信号放大
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操作方案
2.间接ELISA
| 间接 ELISA 特点 |
| 应用 |
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| 优点 |
- 可购买——多种预标记的二抗可商购
- 经济——需要更少的标记抗体
- 高度敏感—— 一抗包含多种表位，可结合多种标记的二抗使信号放大
- 非常灵活——一个二抗可用于检测不同的一抗
- 保留一抗的大免疫反应性
- 不同的可视化标记可用于相同的一抗（例如生物素/链霉亲和素）
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| 缺点 |
- 潜在的二抗交叉反应，导致非特异性染色
- 与直接 ELISA 形式相比，方案更长，因为该方案需要额外的孵育步骤
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操作方案
3.夹心ELISA
| 夹心ELISA特点 |
| 应用 |
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| 优点 |
- 高度灵敏——比直接或间接 ELISA 法灵敏 2 到 5 倍
- 非常灵活——可以使用直接和间接检测
- 高特异性——由于使用了匹配的抗体对，抗原被特异性捕获和检测
- 适用于复杂、粗制或不纯的样品——抗原在测量前不需要纯化
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| 缺点 |
- 匹配抗体对的优化可能很困难——捕获抗体和检测抗体可能会发生交叉反应
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操作方案
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