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一种以微观方式标记抗体的试剂盒

                                                                                 ——ReadiLink 抗体标记试剂盒

 

        ReadiLink 快速抗体标记试剂盒提供了一种以微观方式标记抗体的最便捷方法。 该试剂盒仅需要两个简单的混合步骤而无需纯化步骤。试剂盒中使用的iFluor 和mFluor 染料的琥珀酰亚胺酯(SE)显示出与蛋白质的脂族胺的良好反应性和选择性,并形成羧酰胺键,其与天然肽键相同且稳定。 iFluor 和mFluor-抗体缀合物可用于免疫荧光染色,荧光原位杂交,流式细胞术和其他生物学应用。每个ReadiLink Rapid抗体标记试剂盒都提供了进行两次偶联反应(2x50μg蛋白质)的所有必需成分。每个试剂盒可用于标记50-100μg单克隆,多克隆抗体或其他蛋白质(> 10 kDa),只需两个简单的混合步骤。

 

Readilink 快速试剂盒标记原理

1.通过在反应缓冲液(pH 7.5-8.5)中将标记染料与蛋白质(待标记的)混合,开始标记反应。

2.孵育得到所需蛋白质缀合物和非反应性游离染料的混合物。

3.通过将非荧光Tide Quencher (TQ)染料与反应溶液混合来淬灭反应。TQ染料阻止反应并将非反应性自由标记染料转化为非荧光TQ标记染料复合物,这消除了游离标记染料的背景荧光干扰。

 

试剂盒组成

组分

含量

储存

组分 A:Mitolite Red

2 vial (one vial is for 50 ug protein)

—20℃

组分 B:Live Cell Staining Buffer

1 vial (20uL)

—20℃

组分 C:TQ -Dyed Quench Buffer

1 vial (20uL)

—20℃

 

标准操作规程(标记50μg蛋白质)

将所有组分加热并在打开前将样品瓶短暂离心,并在开始结合前立即准备所需的溶液。 以下SOP是标记抗HDAC IgG抗体的实例。

 

1.准备蛋白质溶液(溶液A):

为了标记50μg蛋白质(假设目标蛋白质浓度为1 mg / mL),将5μL(总反应体积的10%)反应缓冲液(组分B)与50μL目标蛋白质溶液混合。

注1:如果蛋白质浓度不同,请相应调整蛋白质体积,使~50μg蛋白质可用于标记反应。

注2:为了标记100μg蛋白质(假设目标蛋白质浓度为1 mg / mL),将10μL(总反应体积的10%)反应缓冲液(组分B)与100μL目标蛋白质溶液混合。

注3:蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中;如果蛋白质溶解在甘氨酸缓冲液中,必须用1X PBS(pH 7.2-7.4)透析,或使用Amicon Ultra-0.5,Ultracel-10膜,10 kDa(来自Millipore的cat#UFC501008)去除游离胺或铵盐(如硫酸铵和乙酸铵)。

注4:用牛血清白蛋白(BSA)或明胶稳定的不纯抗体。                                 

注5:如果蛋白质浓度低于1 mg / mL,结合效率会显著降低。为获得最佳标记效率,建议最终蛋白质浓度范围为1-2 mg / mL。

 

2.运行结合反应:

2.1将蛋白质溶液(溶液A)加入一小瓶标记染料(组分A)中,通过反复移液几次将其充分混合,或将小瓶涡旋几秒钟。

注意:使用标记染料的两个小瓶(组分A)通过将100μg蛋白质分成2x50μg蛋白质并使每个50μg蛋白质与一小瓶标记染料反应来标记100μg蛋白质。 将两个小瓶合并用于下一步。

2.2将缀合反应混合物在室温下保持30-60分钟。

注意:如果需要,可以旋转或摇动缀合反应混合物更长的时间。

 

3.停止共轭反应:

3.1加入5uL(50μg蛋白质)或10μL(100μg蛋白质),这是TQ染色猝灭缓冲液(组分C)总反应体积的10%到共轭反应混合物中(来自步骤2.2),混合。

3.2在室温下孵育10分钟。

3.3使用标记的蛋白质(抗体)。

 

蛋白质共轭物的储存

蛋白质缀合物应在载体蛋白(例如0.1%牛血清白蛋白)存在下以> 0.5mg / mL储存。 为了更长时间的储存,可以将蛋白质缀合物冻干或分成单次使用的等分试样并在≤-20℃下储存。

 

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