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将组织包埋在石蜡中进行免疫组织化学(AAT)

 

      免疫组织化学(IHC)是在组织形态学背景下监测蛋白质表达和定位的常用技术。它使用抗体来检测和分析蛋白质表达,同时保持天然组织的组成,细胞特征和结构。化学固定将细胞内和细胞间的分子相互作用锁定在适当的位置。组织样品可以包埋在石蜡中或冷冻,然后切成薄片并固定在载玻片上进行分析。组织的收集,保存和固定可能会因样品或感兴趣的目标而有很大差异。IHC通过特异性抗体结合来鉴定生物样品中蛋白质表达的存在和模式。抗体与其表位之间发生的精确结合可以检测蛋白质中靶向特定区域,结构域或切割产物的高特异性氨基酸序列。抗体还可以检测蛋白质上的特定翻译后修饰(PTM)。

      IHC用于疾病诊断,生物学研究和药物开发。例如,使用特定的肿瘤标记物,医生使用IHC来诊断肿瘤是良性还是恶性,确定其阶段和等级,并确定转移的细胞类型和起源,以便找到原发肿瘤的部位。使用IHC作为主要工具或确证程序,可以诊断出多种其他非肿瘤性疾病和病症。在研究背景下,IHC可以单独使用,也可以与其他分析技术结合使用,以研究例如正常组织和器官的发育,病理过程,伤口愈合,细胞死亡和修复以及许多其他领域。

 

样品制备

1.将石蜡浸润的组织放在带有少量液体石蜡的模具中。短暂冷却以固定组织,将纸盒放在模具上。装满液体石蜡,然后冷却。

2.在切片机上切成薄片,然后在水浴中漂浮切片。

3.将切片装在载玻片上并干燥过夜。

 

脱蜡/再水化

注:要进行抗体染色,必须从样品中除去石蜡,并且必须水化。过度干燥会导致不一致的染色。

1.除石蜡,将切片分别放在新鲜的二甲苯中3分钟。

2.开始再水化过程,请将切片放在两个100%乙醇的容器中,每次3分钟。

3.在两个装有95%乙醇的容器中孵育切片,每次1分钟。

4.将切片放在70%的乙醇中1分钟。

5.完成再水化过程,请在dH2O中将切片洗两次,每次5分钟。

 

抗原提取

注意:请参阅产品数据表以获取有关抗体特异性方案。 过热或过热可能导致不一致的染色。

1.柠檬酸盐缓冲液:

在1X柠檬酸盐溶液中加热载玻片直至开始沸腾;然后在亚沸点温度(95℃-98℃)下持续20分钟。在工作台上冷却切片20分钟。

2.EDTA:

将载玻片在1mM EDTA(pH 8.0)中煮沸;然后在低于沸点的温度下加热15分钟。(无需冷却。)

3.TE:

将玻片在10mM Tris / 1mM EDTA(pH 9.0)中煮沸;保持沸腾温度18分钟。在室温下冷却30分钟。

 

染色

1.用dH2O清洗切片3次,每次5分钟。

2.将切片在3%过氧化氢中孵育10分钟。(注意:此步骤对于淬灭内源性过氧化物酶活性很重要,这将有助于减少高背景染色)。

3.在dH2O中清洗两次,每次5分钟。

4.为防止非特异性结合,请在室温下用首选的封闭溶液封闭每个切片30分钟。(使用相同物种的血清作为二抗的来源。)

5.除去封闭溶液,并以建议的稀释度添加一抗,以建议的稀释度添加到每个部分。

6.在4°C下孵育过夜。(应按照建议进行潜伏期。)

7.除去抗体溶液,并用洗涤缓冲液洗涤切片3次,每次5分钟。

8.在室温下用结合有HRP的二抗覆盖切片60分钟。

9.用清洗缓冲液清洗切片三遍,每次5分钟。

10.用即用的Stayright Purple覆盖部分。在室温下孵育5-15分钟。(孵育的具体时间根据自身实验而定)。

11.将切片浸入dH2O,用dH2O洗涤5-10分钟。

12.如果需要,对部分进行复染。

13.复染后,用dH2O洗涤两次,每次5分钟。

 

脱水

1.将切片放在70%乙醇中2分钟。

2.将切片放在两个95%乙醇的容器中,每次1分钟。

3.将切片放在两个100%乙醇容器中,每个容器1分钟。

4.将切片放在两次二甲苯洗涤中,每次1分钟。

5.用盖玻片和有机永久性水性固定剂固定,注意避免导致气泡。

6.显微镜下观察。