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小萤问号之钙黄绿素常见问题详解

 

1.钙黄绿素产品的用途是什么?

答:钙黄绿素是用来标记和监测活细胞的细胞功能的一类荧光探针/试剂盒。它只针对活细胞进行染色,不能染已固定的细胞。

注:染色时间不可太久,保持在一天内,一天后,荧光会变得不明显。

 

2.钙黄绿素中带AM与不带AM的探针有什么区别?它们的优点是什么?

答:不带AM的探针可以直接注射进入细胞,而带AM的探针,因为AM 具有细胞膜渗透性,一旦进入细胞,被细胞内酯酶水解为钙黄绿素(Calcein),产生强烈的绿色荧光(Ex/Em= 490nm/515nm)。因不具细胞膜渗透性,从而能被保留在细胞内。Calcein Red和Calcein Deep Red两种类似物,使其能够替代Calcein AM用在活细胞的标记和功能分析的多重标记研究。AM酯是非极性酯,其易于穿过活细胞膜,并且通过活细胞内的细胞酯酶快速水解。AM酯广泛用于非侵入性地将各种极性荧光探针加载到活细胞中。但是,使用AM酯时必须小心,因为它们易于水解,特别是在溶液中。它们应在使用前重新配制成高质量的无水二甲基亚砜(DMSO)。DMSO储备溶液可以在-20℃下干燥储存并避光。在这些条件下,AM酯可以稳定数个月。

 

3.钙黄绿素的染色过程需要注意哪些问题?

答:细胞离心,去培养基,清洗细胞1~2次,以充分去除残留的培养基,稀释成工作浓度为2-5μM (PBS 或 HBSS-HEPES) 有时可添加一定量的非离子表面活性剂如Pluronic F127到Calcein Red ™储存液内来增强其水溶性37℃ 孵育20min~1h用PBS(或者其他缓冲液)洗涤细胞两次去除多余染料。

注:1.细胞活力理想的浓度范围应在4-5μM

       2.如果细胞中含有有机阴离子转运蛋白,可以在细胞培养基中加入丙磺舒(1-2.5 mM)或磺吡酮(0.1-0.25 mM),以减少脱酯化。

       3.因为背景高的原因,需要多清洗细胞几次去除多余染料。

 

4.钙黄绿素适用于哪些仪器?

答:荧光显微镜、流式细胞仪

注:使用流式细胞仪时需要立即分析细胞样品,以确定在零时间没有洗涤的每个细胞的平均荧光。

 

5.钙黄绿素与其他活细胞染料相比有何优势?

答:钙黄绿素与其他同类产品(如CFDA、CFSE等)相比是特别适合染活细胞的荧光探针,因为它的毒性特别低。并且它不会抑制细胞的各种功能,如增殖、趋化性等。

注:钙黄绿素和碘化丙啶(PI)常用于鉴别死活细胞。钙黄绿素的亲脂性很高,可以通过细胞膜,脱去AM后发生强烈绿色荧光;而碘化丙啶(PI)不能通过活细胞的细胞膜,它仅可以穿过死细胞膜,嵌入其DNA螺旋产生红色荧光。由于钙黄绿素与碘化丙啶在490nm处均可被激发,545nm激发仅可观察死细胞。因此,他们被用于活细胞和死细胞双重染色。

 

6.钙黄绿素在作为显色剂时如何很好的溶解?

答:钙黄绿素在在1mol/L的氢氧化钠溶液中,溶解度能达到50mg,并且超声助溶不会破坏其结构。