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细胞样品制备(全)

 

        以下是制备用于细胞测定的细胞样品的一些通用指南。包括微孔板(或微量滴定板)和流式细胞术的应用的实例。具体实验应始终根据每个实验细胞制备方案,并且可能需要针对单个细胞系进行优化。

 

哺乳动物细胞:酶标仪(96/384孔板)

        每个细胞系应根据个体进行评估,以确定最佳细胞密度。可以使用聚-D赖氨酸板促进非贴壁细胞的细胞附着。

 

贴壁细胞

        将细胞在生长培养基中过夜。表1提供了每孔细胞密度的粗略准则。通常,需要长孵育时间(2-3天)的测定应以较低的初始细胞密度进行平板接种。

 

表1:每个微孔板细胞密度指南

 

示例

96孔板

384孔板

标准孵育

钙,NAD/NADH,膜电位

40,000至80,000个细胞/孔/100μL

10,000至20,000个细胞/孔/25μL

长期孵育

扩散,追踪

5,000至10,000个细胞/孔/100μL

2500至5000个细胞/孔/50μL

 

非贴壁细胞

1.离心细胞并小心丢弃上清液(即培养基)。

2.将细胞沉淀重悬于细胞生长培养基或HHBS中。表2提供了重悬浮细胞密度的指南。通常,应在较低的初始细胞密度下重悬需要长孵育时间(2-3天)的测定。

3.将重悬浮的细胞转移到测定微孔板中。

4.在实验之前,在制动器关闭的情况下以800rpm离心微孔板2分钟。

 

表2:每个微孔板细胞密度的指南

 

示例

96孔板

384孔板

标准孵育

钙,NAD/NADH,膜电位

125,000至250,000个细胞/孔/100μL

30,000至60,000个细胞/孔/25μL

长期孵育

扩散,追踪

10,000至20,000个细胞/孔/100μL

5,000至10,000个细胞/孔/50μL

 

哺乳动物细胞:流式细胞术检测

        每个细胞系应根据个体进行评估,以确定最佳细胞密度。为了从板上分离贴壁细胞,建议使用0.5 mM EDTA。可以考虑酶试剂(例如胰蛋白酶,Accutase TM),但需要进行测试以确保细胞表面上的目标受体不受影响。

 

贴壁细胞

        在使用前一天在细胞生长培养基中培养细胞(400,000至800,000个细胞/ mL)

 

非贴壁细胞

1.离心细胞并小心丢弃上清液(即培养基)。

2.将细胞沉淀重悬于 500μL - 1 mL细胞生长培养基或HHBS中,浓度为500,000至1,000,000细胞/ mL。

 

其他细胞类型:制备和裂解

        以下是制备/裂解植物,细菌,哺乳动物或组织细胞样品的一些通用指南。请注意,应根据个体评估每种细胞类型,以确定最佳细胞密度和条件。

 

植物细胞

1.用裂解缓冲液以200mg / mL均化叶子。

2.以2500rpm离心5-10分钟。

3.使用上清液进行测试。

 

细菌细胞

1.通过离心收集细菌细胞(10,000g,0℃,15分钟)。

2.每100至1000万个细胞加入1mL裂解缓冲液,并在室温下孵育处理过的溶液15分钟。

3.以2500rpm离心5分钟。

4.使用上清液进行测试。

 

哺乳动物细胞

1.从平板孔中取出培养基,每1至5百万个细胞(或96孔细胞培养板中50-100μL/孔)加入约100μL裂解缓冲液。

2.将处理过的溶液在室温下孵育15分钟。

3.直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟,然后使用上清液进行测试。

 

组织

1.称取约20mg组织并用冷PBS洗涤。

2.在微量离心管中用400μL裂解缓冲液均化。

3.以2500rpm离心5-10分钟。

4.使用上清液进行测定。