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荧光素酶标记癌细胞的体内生物发光成像

 

        在过去十年中,体内生物发光成像已成为研究生物体内正在进行的生物过程的非侵入性和敏感性工具。基于荧光素酶氧化荧光素产生的光子的检测和定量,该技术已被证明在分析癌细胞和监测肿瘤生长方面特别有用,该技术提供了一种经济有效的洞察疾病如何在体内进展,不需要连续牺牲动物。该方案详细描述了在免疫受损小鼠中获得荧光素酶标记的肿瘤的程序,其可以通过使用光谱成像仪通过生物发光成像来研究。

 

以下是荧光素酶(Cat#12507)标记小鼠癌细胞的方案

        人工构建的质粒是最常用的将外源DNA导入细菌细胞的载体。在该方案中,我们使用含有萤火虫荧光素酶基因的质粒,并将其转化到感受态细胞的培养物中。

 

1.细菌转化

1.1将50μl感受态细胞转移到置于冰上的1.5ml Eppendorf管中。

1.2向管中加入100ng和500ng质粒,并用感受态细胞重悬(移液管重悬,不要使用涡旋)。 

1.3将管在冰上孵育30分钟,每10分钟轻轻重悬。 

1.4将管置于42℃的热块中45秒,然后立即放回冰中2分钟。 

1.5将800μl不含抗生素的LB培养基加入试管中,用移液管轻轻重悬样品(不要使用涡旋)。 

1.6在振荡器培养箱中以37°C速度200rpm培养细菌2-3小时。

1.7在含有100μg/ ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上铺板100μl转化混合物。

1.8将板置于37℃的培养箱中过夜。

1.9挑取单个菌落并接种含有50ml LB培养基+100μg/ ml氨苄青霉素的烧瓶。 

1.10在37℃下在摇床培养箱中以200rpm的速度孵育过夜。

 

2.DNA提取

        纯化质粒DNA,具体取决于细菌培养物的大小及其相应的质粒产量,以及一些可供不同制造商提供的试剂盒。在该方案中,从细菌中分离DNA依赖于使用柱和离心步骤,其中DNA被剪切,提取和沉淀。

 

3.将DNA转染到病毒包装细胞中

        根据质粒,可以使用几个包装细胞来产生所需的病毒。 在该方案中,我们使用第二代逆转录病毒生产细胞系(Phoenix-Ampho),当存在辅助DNA(CMV和DMV)时,其也能够长期稳定地生产慢病毒。 辅助DNA编码病毒基因,增加病毒复制。

3.1在转染前24小时,在10cm 2培养板中,在8ml补充有10%FBS和1%PenStrep的RPMI中培养3×10 6个Phoenix-Ampho细胞。

3.2在第一个1.5 ml Eppendorf管中,加入6μgDNA,3μg每种辅助剂(CMV和DMV),并填充至250μl的150 mM NaCl(每个样品进行转染)。

3.3在第二个1.5 ml管中加入24μl jetPEI和226μl150mM NaCl(每个样品进行转染)。

3.4将管涡旋10秒钟。

3.5将Jetpei + NaCl加入带有DNA的Eppendorf管中并涡旋10秒。

3.6在室温下孵育混合物15分钟。

3.7除去平板培养基,向Phoenix-Ampho细胞中加入9.5ml补充有10%FBS和1%PenStrep的新鲜RPMI(参见步骤3.1)。

3.8将500μl一滴一滴的混合物(步骤3.5)加入板中并在37℃下孵育过夜。

3.9 24小时后更换培养基并加入补充有10%FBS和1%PenStrep的新鲜RPMI。

3.10 48小时后,收集并用0.45μm过滤器将介质过滤到50ml Falcon管中。

注意:在此步骤之后,可以通过连续稀释来测量病毒浓度以获得定量信息。可以使用各种技术来定量病毒浓度,包括传统方法(例如噬斑测定)和试剂盒(例如ELISA或Q-PCR)。

 

4.病毒颗粒细胞感染

        在前一步骤中产生的病毒颗粒用于感染细胞。病毒会感染携带病毒可以结合的受体的细胞。因此,病毒感染的效率将在很大程度上取决于细胞类型。在该方案中,我们用10ml培养基感染在10cm 2培养皿中生长的70%汇合的22Rv1前列腺癌细胞。

4.1将Polybrene加入培养的细胞中至终浓度为10μg/ ml。

注意:Polybrene是一种有效的感染试剂,用于将病毒载体引入哺乳动物细胞。 Polybrene通过中和病毒粒子和细胞表面之间的电荷排斥来起作用(Davis等,2004)。

4.2使用5ml移液管,向培养的细胞中加入4ml过滤的病毒颗粒。

4.3以250×g离心10cm 2板5分钟。

注意:此步骤有助于病毒与细胞表面的物理接触,从而提高感染效率。

4.4将细胞置于37°C,5%CO2培养箱中18-24小时。

注意:孵育时间会影响感染效率。可以使用不同的孵育时间进行故障排除,以确定特定细胞类型的最有效孵育时间。

4.5吸出培养基并加入10ml补充有10%FBS和1%PenStrep的新鲜RPMI。在37°C孵育24小时。

4.6通过向培养基中加入终浓度为2μg/ ml的嘌呤霉素,选择感染的22Rv1前列腺癌细胞。

注意:嘌呤霉素浓度取决于细胞类型。

4.7每3天更换含有嘌呤霉素的培养基。掺入pLenti CMV Puro LUC的细胞将在抗生素选择条件下生长。

4.8检查细胞是否含有荧光素酶质粒。

注意:可以使用多种方法测试成功的荧光素酶。实例是通过PCR检测荧光素酶或测量D-荧光素暴露后的荧光素酶活性(参见图2)。

 

5.将荧光素酶标记的细胞注射到免疫功能不全的小鼠中

        在该方案中,我们进行了荧光素酶标记的肿瘤细胞的皮下注射。 然而,可以根据研究者的偏好进行替代注射部位,例如促进前列腺微环境的小鼠前列腺(正交各向异性)和增强成功植入并保持肿瘤异质性的肾下囊注射。

5.1通过移除培养基收集附着的细胞,用10ml 1x DBPS洗涤细胞两次,并使用2ml 0.05%胰蛋白酶胰蛋白酶消化细胞。 将2ml胰蛋白酶消化的细胞回收至含有4ml RPM1的15ml管中,所述RPM1补充有10%FBS和1%PenStep。

5.2使用血细胞计数器计数细胞。

5.3将悬浮在100μl补充有100μl细胞外基质(1:1比例)的RPMI中的106个细胞混合并置于冰上。

5.4在室内皮下注射麻醉小鼠,在1升/分钟的氧气中提供5%(v / v)吸入的异氟烷。

5.5使用25号针头和1ml注射器,将250μl细胞和细胞外基质悬浮液皮下注射到免疫缺陷NSG小鼠的侧腹中。

 

6.生物发光成像

        光谱成像仪以每秒光子的速度表示生物发光信号,并将其显示为强度图。发光是由荧光素酶表达细胞发射的光子通量的结果,直接与肿瘤的大小相关,并且可以使用ROI工具在注射部位测量。可以调整光学发射图像以提供最佳对比度和分辨率。

6.1在1x DPBS中制备15mg / ml的D-荧光素的新鲜储备溶液。

6.2使用异氟烷蒸发器麻醉小鼠,并将它们放入成像仪的相机盒内。

6.3运行成像。

6.4将小鼠置于背侧卧位(腹部朝上)并在成像前5分钟腹膜内(ip)注射150mg / kg D-荧光素(来自步骤F1)。优选的注射区域是腹部区域的小鼠右下象限。

6.5考虑到肿瘤细胞摄取时间依赖性D-荧光素,每2分钟运行小鼠的连续图像,直至达到发光饱和度。

 

荧光分析

图3.细胞中的荧光素酶检测。多种方法可用于检测细胞感染的成功,包括但不限于:a.通过PCR检测荧光素酶基因b.检测荧光素酶活性。

 

图4.小鼠皮下注射细胞。 A.抬起颈部后面的皮肤做一个帐篷。 B.将针头插入帐篷底座,使其平行于动物的身体,以避免刺破下面的结构。 C.吸气以产生轻微真空并确保针头未进入血管。 缓慢注射细胞和细胞外基质悬浮液。

 

图5.体内成像的生物发光。 A.代表荧光素酶时间过程(每2分钟)成像小鼠皮下注射荧光素的皮下肿瘤。 B.图表说明直到时间点8分钟时获得的整个小鼠的生物发光饱和度(显示在A中),此时确定实验结束。

 

参考文献

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