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AAT 研发的新型钙离子荧光探针 点亮你的科研之路

 

        Calbryte 520,Calbryte 590 和 Calbryte 630 提供最强大的均匀荧光测定工具,用于检测细胞内钙动员。与现有的钙指示剂(如 Fluo-3 AM,Fluo-4 AM 和Rhod-2 AM)相比,这些钙敏感染料明显更亮,并提供更高的信噪比,大大提高了细胞内保留和负载效率。通过钙发出信号的 GPCR 或钙通道的细胞可以预装载穿过细胞膜的 Calbryte 520 AM,Calbryte 590 AM 或 Calbryte 630 AM。一旦进入细胞内,Cal520 AM,Calbryte 590 AM 或 Calbryte 630 AM 的亲脂性阻断 AM 基团被细胞内酯酶切割,产生带负电荷的荧光 Calbryte 染料,留在细胞内。它们与钙结合后的荧光大大增强。当用激动剂刺激细胞时,该受体表达细胞内钙的释放,这显着增加了 Calbryte 520,Calbryte 590 或 Calbryte 630 的荧光。高灵敏度和> 100 倍荧光增强的特性使 Calbryte 520 AM, Calbryte 590 AM 或Calbryte 630 AM 是测量细胞内钙的最强大指标。

        这些钙离子荧光探针具有方便的激发波长和钙的大荧光增强,Calbryte 520,Calbryte 590 和Calbryte 630 主要定位于细胞溶胶中,不像 Rhod-2 主要位于线粒体中。 此外,Calbryte 590 和 Calbryte 630 的 Ex / Em 波长使这些染料成为完美的钙指示剂,可与绿色荧光蛋白(GFP)细胞系进行多色检测。 此外,Calbryte 520,Calbryte 590 或 Calbryte 630 钙测定经过优化,可与大多数现有荧光仪器兼容。Calbryte 520 可在 488 nm 处激发,并与 FITC 滤光片组配合使用。 Calbryte 590经过优化,可在 555 nm 激发,并与 TRITC / Cy3 滤光片组配合使用。 Calbryte 630 经过优化,可在 594 nm 激发,并与 TexasRed®滤光片组配合使用。 光谱和钙结合特性总结如下(见表 1)。

 

表 1.Calbryte 520,Calbryte 590 或 Calbryte 630试剂的光谱和Ca2+结合特性

钙离子指示剂 Ex(nm) Em(nm) Kd(uM)
Calbryte 520 492 514 1.2
Calbryte 590 580 592 1.4
Calbryte 630 608 624 1.2

 

使用 Calbryte 520 AM ,Calbryte 590 AM 或 Calbryte 630 AM 酯类须知

1.使用 Calbryte 520 AM ,Calbryte 590 AM 或 Calbryte 630 AM 酯类操作方案

        Calbryte AM 酯应在使用前在无水 DMSO 中重新配制。 DMSO 储备溶液可以在-20℃下储存(干燥)并避光。 在这些条件下,AM 酯应稳定三个月。

        以下是我们推荐的将 Calbryte 520 AM,Calbryte 590 AM 或 Calbryte 630AM 酯加入活细胞的方案。 该说明仅提供指南,实际应根据您的特定需求进行修改。

a.在 无 水 DMSO 中 制 备 2 至 5mM Calbryte 520AM , Calbryte 590AM 或Calbryte 630AM 酯的储备溶液。

b.将 Calbryte 520 AM,Calbryte 590 AM 或 Calbryte 630 AM 溶解在DMSO 中或将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。 在 Hanks 和 Hepes 缓冲液(HHBS)或您选择的缓冲液(0.04%Pluronic®F-127)中制备 10 至 20μM 的染料工作溶液。细胞加载所需指示剂的确切浓度必须根据经验确定。

注 意 : 非 离 子 型 洗 涤 剂 Pluronic®F-127 有 时 用 于 增 加 Calbryte 520 AM ,Calbryte 590 AM 或 Calbryte 630 AM 酯的水溶性。

c.如果您的细胞(如 CHO 细胞)含有有机阴离子转运蛋白,可将丙磺舒(1-2 mM)添加到染料工作溶液中(最终浓度为 0.5-1 mM)。

d.将等体积的染料工作溶液(来自步骤 b 或 c)加入细胞板中。

e.将染料加载板在细胞培养箱中孵育约 60 分钟,然后将板在室温下再孵育 15 分钟。

f.用 HHBS 或您选择的含有阴离子转运蛋白抑制剂(如 1 mM 丙磺舒)的缓冲液替换染料工作溶液,以去除多余的染料。

g.对于 Calbryte 520 AM,在 Ex / Em = 490 / 525nm 处进行钙测试,对于Calbryte 590 AM,使用 540/590nm 进行钙测试,对于 Calbryte 630 AM,使用 610/640nm 进行钙测试。

 

2.测量细胞内钙响应

 

图 1. CHO-K1 细胞中内源性 P2Y 受体对 ATP 的反应。 将 CHO-K1 细胞以每孔 100μL 每孔 40,000 个细胞接种过夜,在 96 孔黑色壁/透明底板中。 将含有丙 磺舒的 HHBS 中的 100μ LFluo- 4AM 或 Calbryte TM 520AM 加 入 孔中,并将细胞在 37℃下孵育 45 分钟。用 200 μ LHHBS 替 换 染 料 加 载 培 养基,加入 50μL50μMATP,并使用FITC 通道用荧光显微镜(Keyence)成像。

图 2.用 Calbryte 520 或 Fluo-4 AM 测量的 CHO-M1 细胞中外源 M1 受体的卡巴胆碱刺激的钙响应。 在 96 孔黑壁/透明底板中,将 CHO-M1 细胞以每100μL/孔 40,000 个细胞接种过夜。 将100 μ LFluo-4 AM 或 不 含 丙 磺 舒 的Calbryte 520AM 加入细胞中,并将细胞 在 37 ℃ 下 孵 育 45 分 钟 。 通 过FlexStation 3 ( Molecular Devices ) 添加 Carbachol(50μL/孔)以达到最终指示的浓度。

 

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名称 货号 规格(ug) 价格
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