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百萤问号:DNA检测的相关问题解答

English title: Biolite:DNA assay FAQ

百萤对近客户们关于DNA检测时提到的问题进行了总结归纳,希望可以给大家带来一些小的帮助。


 

1.末端转移酶(TdT)是否可以标记DNA的3'和5'末端?

答:末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)只能标记DNA的3'末端。在3'OH突出端添加dNTPs比在3'OH凹或钝(平)端添加dNTPs更有效。


 

2.是否有与DNA和RNA相互作用的双荧光核酸染料?

答:羟芪巴脒吖啶橙与DNA和RNA相互作用。

羟芪巴脒,#17514,是一种荧光染料,当与DNA(Ex / Em = 360 / 590nm)和RNA(Ex / Em = 360/540 nm)结合时,会发出截然不同的荧光发射曲线。

吖啶橙,#17502,是可以透过细胞的阳离子染料,可通过嵌入或静电吸引作用与DNA(Ex / Em = 502/525 nm)和RNA(Ex / Em = 460/650 nm)相互作用。


 

3.如何确定DNA纯度?

答:可以通过测量260和280 nm处的样品吸光度并确定它们的比率来确定样品中的DNA纯度,其中1.7–2.0的比率表示纯DNA样品。在260和280 nm处吸收的污染物可能会导致样品中的DNA被高估。


 

4.线粒体DNA(mtDNA)与核DNA有何不同?

答:mtDNA是线粒体DNA,在许多特征上与核DNA不同(见表1)。

表1.mtDNA和核DNA之间的差异

特征 线粒体DNA 核DNA
存在位置 线粒体基质 细胞核
形状 DNA环状链 排列在线性染色体上
基数 16,569 3,300,000,000
复制数 2
基因数 37 20,000-30,000
遗传 产妇 母婴
非编码DNA基因组比例 3% 93%

 

5.如何计算DNA浓度?

答:可以通过在分光光度计中测量样品在260nm处的吸光度并使用比尔-朗伯定律计算浓度来确定DNA浓度。为此,您需要确定以cm -1 M -1为单位的DNA的消光系数。

不同核酸碱基的平均消光系数:

ds DNA:Ec = 6600 cm -1 M -1,MW = 330

单链DNA:Ec = 8919 cm -1 M -1,MW = 330

RNA:Ec = 8250 cm -1 M -1,MW = 340

 

计算DNA浓度的方法:

双链DNA:50 μg/ml OD = 1; CON(μg/mL)=Abs.x 50 μg/ml

SS DNA:50 μg/ml OD = 1.35; CON(μg/mL)=(Abs./1.35)x 50 μg/ml

RNA:50 μg/ml OD = 1.21; CON(μg/mlL=(Abs./1.21)×50 μg/ml

使用AAT Bioquest的DNA浓度计算器,通过260 nm处的吸光度读数确定DNA溶液的浓度。可以通过输入核酸序列来计算任何核苷酸的浓度。


 

6.核红 LCS1(Cat#17542)是否可以固定?

答:是的,您可以使用Nuclear Red LCS1染色活细胞中的DNA,然后固定您的细胞。 


 

7.除了溴化乙锭(EBr),琼脂糖凝胶中的核酸染色还有哪些其他选择?

答:Cyber​​ Green (Cat#17590)(Cat#TJ1700)和Cyber​​ Orange (Cat#17595)是出色的核酸凝胶染料,在琼脂糖凝胶中检测DNA时,其灵敏度比EBr敏感,并且诱变性明显低于EBr。

Cyber​​ Green 可用于qPCR,熔解曲线分析,嗜热解​​旋酶=依赖性扩增(tHDA)的实时监测,常规溶液DNA定量和各种凝胶电泳。稀释后的Cyber​​ Green 浸泡的凝胶无需脱盐即可看到。 

当对凝胶中的寡核苷酸染色时,我们建议在EBr上使用Gelite 绿色核酸凝胶染色试剂盒(Cat#17589)。Gelite Green的EBr灵敏度高两个数量级,每条带可检测低至60 pg dsDNA。

还有TJ系列核酸凝胶染料,它们是SYBR®Green、SYBR®gold等产品的佳替代品,它们便宜实用,荧光强度、灵敏度却丝毫不输进口产品,是常做核酸凝胶实验的佳选择。


 

8.PCR的四个步骤是什么?

答:PCR包括以下四个步骤:

  1. 加热变性:通过称为变性的过程将双链DNA分为两条单链,该过程发生在高于90摄氏度的温度下。热使碱基对之间的氢键断裂,而脱氧核糖和磷酸根之间的较强键保持完整。
  2. 使引物退火至靶序列:在复制靶序列(通常在100-600个碱基对之间)之前,必须使用通过退火(结合)至互补序列靶向靶DNA序列末端的引物靶向。退火发生在较低的温度下(40到65摄氏度之间),具体取决于引物的长度和碱基序列。
  3. 延伸:退火后,温度升高到72摄氏度,Taq DNA聚合酶用于复制DNA链。在合成(或延伸)过程中,合成了两个相同的双链DNA分子。
  4. 第一个PCR周期的结束:此后,通常重复此过程25至35次。


 

9.dsDNA和ssDNA有什么区别?

答:dsDNA是双链DNA,而ssDNA是单链DNA,尽管它们两者都携带遗传物质,但它们有许多差异(见表2)。

表2. dsDNA和ssDNA之间的差异

特征 双链DNA 单链DNA
存在 几乎所有生物 病毒很少(例如φX174)
形状 线状或丝状 星状或星形
稳定性 更稳定 不稳定
A:T 1 ~0.77
G:C 1 1.3
查格夫法则(Chargaff's rules) 可用 不可用
与甲醛反应 具有耐性 高度易感
嘌呤:嘧啶比率 1 变量(易变)

 

10.PCR有哪些不同类型?

答:

PCR的类型很多:

  • 实时PCR(定量PCR或qPCR)–使用荧光染料标记DNA分子,用于实时监测和定量PCR产物
  • 逆转录PCR(RT–PCR) –使用逆转录酶将RNA逆转录成DNA,从而创建互补的DNA(cDNA)
  • 多重PCR(Multiplex PCR) –使用多种引物在一个DNA样品中扩增多个片段
  • 巢式PCR(Nested PCR) –在初的25-35个PCR循环后,使用“嵌套”在原始引物中的新引物进行额外的PCR,从而降低了不需要的产物的风险
  • 热启动PCR(Hot start PCR) –通过加热使用于灭活Taq聚合酶的抗体变性
  • 长片段PCR(Long PCR) –通过使用聚合酶混合物可形成更长范围的DNA
  • 组装PCR(Assembly PCR) –使用重叠引物扩增更长的DNA片段
  • 非对称PCR(Asymmetric PCR) –仅扩增靶DNA的一条链
  • 原位PCR(In situ PCR) –在细胞或载玻片固定组织中进行的PCR

 

11.DNA提取的步骤是什么?

答:DNA提取涉及3个基本步骤,即裂解、沉淀和纯化。

1.在裂解中,细胞核和细胞破裂,从而释放出DNA。这个过程涉及机械破坏,并使用诸如蛋白酶K之类的酶溶解细胞蛋白和游离DNA。

2.另一个步骤称为沉淀,将释放的DNA与细胞碎片分离。它涉及使用钠(Na+)离子中和DNA分子中的任何负电荷,使它们的水溶性降低,更稳定。然后加入酒精(例如异丙醇或乙醇),由于其不溶于酒精,导致DNA从水溶液中沉淀出来。

3.从水溶液中分离出DNA后,再用乙醇冲洗,这一过程称为纯化。纯化去除所有剩余的细胞碎片和不需要的物质。DNA完全纯化后,通常会再次溶解在水中,以方便存储和处理。


 

12.HeLa细胞中的总DNA含量是多少?

答:对于HeLa细胞,每个HeLa细胞的总DNA含量约为15 pg


 

13.PCR扩增需要什么材料?

答:

使用PCR扩增DNA所需的材料是:

  • 含有靶序列的分离DNA样品
  • 靶序列特异的DNA引物
  • DNA引物
  • 原始核苷酸(DNA构建基块)
  • DNA聚合酶和稳定的溶液(PCR缓冲液)

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