首页 > 技术天地 > 病毒DNA/RNA的PCR检测

病毒DNA/RNA的PCR检测

在病毒诊断中,核酸扩增测试,例如逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR),可以及早发现和识别被称为逆转录病毒的传染病。在这个标准 PCR 过程中,作为初始模板的 mRNA 首先被逆转录为互补 DNA (cDNA),然后通过 PCR 扩增以进行下游分析。相对于其他测量 mRNA 的技术,例如 Northern 印迹分析、RNAse 保护分析或原位杂交,RT-PCR 在检测任何基因的 RNA 转录物方面更加稳定,而不管其相对丰度如何。 RT-PCR 已成为检测病原体的仪器诊断工具,包括流感病毒、肠道病毒、冠状病毒 (SARS-CoV-2)、埃博拉病毒和 HIV。

 

逆转录病毒

逆转录病毒是一种病毒,其遗传物质由 RNA 编码。与其他病毒类似,逆转录病毒劫持细胞以复制自身的副本。感染细胞后,逆转录病毒利用其自身的逆转录酶从其 RNA 基因组中生成双链 DNA。新合成的病毒 DNA 被整合到宿主细胞基因组中,然后病毒作为宿主细胞 DNA 的一部分进行复制。

在人类中,许多逆转录病毒会导致严重的疾病。 HIV-1 和 HIV-2 等逆转录病毒会导致艾滋病,而人类 T 淋巴细胞病毒会导致白血病(即血液癌)和脱髓鞘疾病。此类疾病的严重性和新出现的传染病的持续威胁再次证实了开发能够检测低密度感染的快速诊断工具的必要性。用于早期检测逆转录病毒感染的最完善的工具之一是核酸扩增测试。


核酸扩增试验

核酸扩增测试是检测少量特定核酸序列,以识别特定病原体,通常是病毒或细菌。核酸扩增测试不是检测抗原或抗体(血清学分析的目标),而是针对并检测遗传物质,例如 DNA 或 RNA。遗传物质的检测允许在血清转化之前对感染进行早期诊断,在此期间,特异性抗体针对病原体产生并在血液中可检测到。常见的核酸扩增试验包括逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)、链置换试验 (SDA) 或转录介导试验 (TMA)。

逆转录 PCR (RT-PCR)

逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 是一种用于检测和定量 mRNA 表达水平的高度灵敏的技术。在 RT-PCR 中,首先使用逆转录酶将 RNA 模板逆转录为互补 DNA (cDNA)。这种依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶在逆转录引物脱氧核苷酸(dNTP:dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP)的帮助下,催化从其各自的目标 RNA 序列合成 cDNA。然后将 cDNA 用作使用标准 PCR 程序(变性、退火和延伸)进行指数扩增的模板。 RT-PCR 用于多种应用,包括基因表达分析、微阵列验证、病原体检测和疾病研究。

RT-PCR产物的定量一般可分为两大类:终点RT-PCR和定量RT-PCR(RT-qPCR)。 

表1. 用于 PCR、实时 PCR 和逆转录 PCR 的脱氧核苷酸 (dNTP)

产品名称 溶剂 规格 货号
ReadiUse™ dNTP Mix *10 mM* Water 5 mL 17200

 

终点RT-PCR

终点 RT-PCR 分析基于 PCR 反应的平台期,用于在 PCR 反应的所有循环完成后分析扩增产物。在此方法中,扩增子通过琼脂糖凝胶电泳分离,并使用 DNA 结合染料(如溴化乙锭 (EtBr))进行检测,以确定 500 至 30,000 bp 范围内的 DNA 分子大小。虽然 EtBr 是最常用的 DNA 染料,但它具有致突变性和吸入毒性。相反,请考虑使用更安全、更环保、无毒的替代品,例如 Gelite X100(货号 17706)、Helixyte Green(货号 17590)、Helixyte Gold(货号 17595)、Gelite Green(货号 17589)或 Gelite Orange(货号 17594)。

表2. 定量 RT-PCR 产物的终点 RT-PCR 检测方法

终点RT-PCR 概述
相对RT-PCR
  • 使用与基因特异性引物复合的内部对照引物
  • 需要兼容的内部对照和基因特异性引物
  • 可以比较多个样本的相对转录本丰度
  • 结果表示为基因信号与内控信号的比值,可用于样本间的比较,估计相对靶RNA的表达
竞争性RT-PCR
  • 用于对样本中特定 mRNA 序列进行绝对定量的技术。
  • 将合成 RNA 和竞争 RNA 添加到样品 RNA 复制品中,并与内源性靶标共同扩增
  • 生成竞争者 RNA 的浓度曲线,用于比较内源性转录本产生的 RT-PCR 信号,以确定样品中存在的靶标量
比较RT-PCR
  • 与竞争性 RT-PCR 相似,目标 RNA 在单一反应中与无关序列的内标竞争扩增试剂
  • 结果与外部标准曲线进行比较以确定目标 RNA 浓度
  • 三种方法中更方便,因为它不需要预先确定 mRNA(相对 RT-PCR)或合成合成竞争性 RNA(竞争性 RT-PCR)

表3. 终点RT-PCR的优缺点及应用

终点RT-PCR
优点
  • 方便 - 适用于任何双链 DNA 序列的分析
  • 经济 - 比使用定制设计的探头便宜
缺点
  • 精度差,灵敏度低
  • 短动态范围 < 2logs
  • 低分辨率,仅进行大小的区分
  • 不适合自动化
  • 结果不表示为数字
  • PCR后处理
应用
  • 基因表达分析
  • 克隆
  • 构建 cDNA 文库
  • RNA测序
  • 微阵列探针开发
  • 物种鉴定

表4. 琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳用核酸染色剂

产品名称 Ex (nm) 滤波片 规格 货号
Cyber Green 核酸凝胶染料 10000X DMSO 254 mn Long path green filter 1 mL 17590
Cyber Green 核酸凝胶染料 [相当于 SYBR® Green] *10,000X DMSO 溶液* 254 mn Long path green filter 100 µL 17604
Cyber Orange 核酸凝胶染料 10000X DMSO 254 mn Long path green filter 1 mL 17595
Gelite 绿色核酸凝胶染色试剂盒 254 nm or 300 nm Long path green filter 1 Kit 17589
Gelite 橙色核酸凝胶染色试剂盒 254 nm or 300 nm Long path green filter 1 Kit 17594
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X水溶液* 254 nm, 300 nm or 520 nm Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters 100 µL 17700
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X水溶液* 254 nm, 300 nm or 520 nm Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters 500 µL 17701
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X水溶液* 254 nm, 300 nm or 520 nm Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters 1 mL 17702
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X水溶液* 254 nm, 300 nm or 520 nm Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters 10 mL 17703
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X DMSO溶液* 254 nm, 300 nm or 520 nm Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters 100 µL 17704
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X DMSO溶液* 254 nm, 300 nm or 520 nm Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters 500 µL 17705
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X DMSO溶液* 254 nm, 300 nm or 520 nm Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters 1 mL 17706
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X DMSO溶液* 254 nm, 300 nm or 520 nm Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters 10 mL 17707

 

定量RT-PCR

在定量 RT-PCR (RT-qPCR) 中,荧光 DNA 嵌入染料或序列特异性荧光探针被整合到 RT-PCR 反应中,允许在 PCR 的指数阶段实时测量扩增子浓度。通过将扩增和检测结合到一个步骤中,RT-qPCR 提供更高的精确度和准确度,并产生动态范围比终点 RT-PCR 大几个数量级的定量数据。由于其更高的灵敏度,RT-qPCR 通常用于分析基因表达中的 mRNA、检查逆转录病毒的存在以及验证通过阵列分析获得的结果。

用于 RT-qPCR 的 Helixyte Green

使用荧光DNA 嵌入染料(例如 Helixyte Green(货号 17591))的 RT-qPCR 为实时检测和定量 PCR 扩增子提供了最简单、最经济的方法。 Helixyte Green 与双链 DNA (dsDNA) 结合,并在激发时发光。随着每个连续扩增循环的扩增子浓度增加,Helixyte Green 的荧光强度也会增加,其程度与每个 PCR 循环中存在的 dsDNA 量成正比。 Helixyte Green 是比高度诱变的EtBr 更安全的替代品,可用于以更高的灵敏度和更少的 PCR 抑制检测任何 dsDNA 序列的扩增。由于 DNA 嵌入染料会与任何 dsDNA 结合,例如引物二聚体和非特异性产物,因此使用精心设计的引物以避免扩增非目标序列非常重要。为确保扩增特异性并检查引物二聚体伪影,应在扩增后进行熔解曲线分析。

表5. 用于 qPCR 的双链 DNA 结合染料

产品名称 Ex (nm) Em (nm) 规格 货号
Cyber Green 20X水溶液PCR定量 498 nm 522 nm 5x1 mL 17591
Cyber Green 10000X水溶液PCR定量 498 nm 522 nm 1 mL 17592
Helixyte Green 双链DNA定量试剂 490 nm 525 nm 1 mL 17597
Helixyte Green 双链DNA定量试剂 490 nm 525 nm 1 mL 17598
Q4ever Green核酸染料 *2000X DMSO 溶液* 503 nm 527 nm 50 µL 17608
Q4ever Green核酸染料 *2000X DMSO 溶液* 503 nm 527 nm 1 mL 17609

用于 RT-qPCR 的 TaqMan® 探针和分子信标

在RT-qPCR 中,荧光标记的目标特异性探针用于实时测量 DNA 扩增。这种方法受益于极高的特异性,并为最终用户提供了在单个反应中多重检测多个目标的机会。在许多可用的基于探针的 RT-qPCR 化学中,TaqMan® 探针和分子信标是使用最广泛的,两者都依赖于共振能量转移 (FRET) 来产生荧光信号。 TaqMan® 探针依赖于 Taq DNA 聚合酶的 5'-核酸酶活性。与目标靶标互补的短寡核苷酸序列在 5' 端用荧光报告染料标记,在 3' 端用非荧光猝灭染料标记。在 PCR 循环期间,引物和探针与目标退火。当 Taq DNA 聚合酶与探针上游的引物结合并延伸时,杂交的探针被水解,含有报告染料的片段被释放。现在可以检测荧光信号,产生的荧光信号量与产生的 qPCR 产物量成正比。

与 TaqMan® 探针一样,分子信标在 5' 端用荧光报告染料标记,在 3' 端用非荧光淬灭染料标记。然而,该方法不依赖于 Taq DNA 聚合酶的 5' 核酸酶活性来产生信号,而是分子信标被设计为在整个扩增过程中保持完整。在没有目标的情况下,分子信标由于其自我互补的茎结构而保持在“发夹”确认中。这使荧光报告基因和淬灭染料彼此靠近,从而防止探针发荧光。当分子信标与其目标杂交时,荧光报告基团和猝灭基团分离,报告基团染料以其特征波长发光。

我们提供范围广泛的染料亚磷酰胺和染料 CPG 支持物,用于开发 FRET 寡核苷酸、TaqMan® 探针和分子信标。该产品包括经典染料,例如 FAM、HEX、TET 和 JOE,以及卓越的寡标记染料,例如 Tide Fluor 和 Tide Quencher 染料。

注:经典荧光染料TideFluor/TideQuencher染料,可在百萤网站查询

表6.  FRET 寡核苷酸的推荐 FRET 对

供体/受体 DABCYL TQ1 TQ2 TQ3 TQ4 TQ5 TQ6 TQ7
EDANS +++ +++ + - - - - -
MCA +++ +++ + - - - - -
Tide Fluor 1 +++ +++ + - - - - -
FAM
FITC
+ + +++ + - - - -
Cy2®
Tide Fluor 2
+ + +++ + - - - -
HEX
JOE
TET
- - + +++ + - - -
Cy3®
TAMRA
Tide Fluor 3
- - + +++ + - - -
ROX
Texas Red®
- - - + +++ + - -
Tide Fluor 4 - - - + +++ + - -
Cy5®
Tide Fluor 5
- - - - + +++ + -
Cy5.5®
Tide Fluor 6
- - - - - + +++ +
Cy7®
Tide Fluor 7
- - - - - - + +++

 

用于标记寡核苷酸和肽的 Tide Fluor 染料

Tide Fluor 染料是一系列供体染料,用于开发用于各种生物应用的 FRET 寡核苷酸和肽。与 EDANS、FAM、TAMRA、ROX、Cy 3 和 Cy5 等常见供体染料相比,Tide Fluor 染料具有更强的荧光和更高的光稳定性。它们是最经济实惠的荧光染料,用于标记肽和寡核苷酸而不会牺牲性能。

表7. 用于定量 RT-PCR 产物的 Tide Fluor 染料和光谱特性

染料 Abs (nm) Em (nm) ε Φ CF at 260 nm CF at 280 nm
Tide Fluor 1 345 442 20000 0.95 0.246 0.187
Tide Fluor 2WS 502 525 75000 0.9 0.211 0.091
Tide Fluor 2 500 527 75000 0.9 0.288 0.201
Tide Fluor 3WS 555 565 150000 0.105 0.079 0.079
Tide Fluor 3 555 584 85000 0.85 0.331 0.201
Tide Fluor 4 590 618 90000 0.91 0.489 0.436
Tide Fluor 5WS 649 664 250000 0.25 0.023 0.027
Tide Fluor 6WS 676 695 220000 0.18 0.111 0.009
Tide Fluor 7WS 749 775 275000 0.12 0.009 0.049
Tide Fluor 8WS 775 807 250000 0.08 0.103 0.109

 

用于标记寡核苷酸和肽的 Tide Quencher 染料

尽管 DABCYL 已被用于开发各种 FRET 应用,但其对较长波长染料(如荧光素、罗丹明和花青)的低淬灭效率限制了其在敏感荧光 FRET 探针的开发中的使用。此外,DABCYL 的吸收光谱对环境敏感。 百萤开发了强大的 Tide Quencher 受体染料,用于开发更长波长的 FRET 探针。 Tide Quencher 染料是消除经典淬灭剂局限性的绝佳选择。

Tide Quencher 染料的主要优点:

  1. 探索其他猝灭剂可能无法实现的 FRET 潜力
  2. 多功能反应形式便于自行构建所需的 FRET 生物分子
  3. 完美匹配您想要的荧光供体
  4. 具有竞争力的价格和更好的性能
TF and TQ Probes
图2. Tide Fluor 染料作为供体或 Tide Quencher 染料作为受体的分子信标寡核苷酸探针的杂交诱导荧光增强对比图。

表8. 用于定量 RT-PCR 产物的 Tide Quencher 染料和光谱特性

Quencher染料 Abs (nm) ε CF at 260 nm CF at 280 nm
Tide Quencher 1 488 20,000 0.147 0.194
Tide Quencher 2 512 21,000 0.100 0.120
Tide Quencher 2WS 515 21,000 0.100 0.120
Tide Quencher 3 576 22,000 0.085 0.091
Tide Quencher 3WS 576 90,000 0.186 0.205
Tide Quencher 4 604 23,000 0.146 0.183
Tide Quencher 4WS 604 90,000 0.149 0.136
Tide Quencher 5 661 24,000 0.170 0.082
Tide Quencher 5WS 661 130,000 0.072 0.082
Tide Quencher 6WS 691 130,000 0.120 0.102
Tide Quencher 7WS 759 140,000 0.072 0.091

百萤生物是美国AAT Bioquest中国区域代理商,为您提供AAT Bioquest最优质的产品、最详尽的技术和最前沿的资讯,欢迎来电咨询!