用于GPCR和钙离子通道功能分析的一系列钙指示剂（一）

今天百萤给大家系统的介绍一下AAT Bioquest的钙离子荧光探针。AAT Bioquest研发的钙离子探针与其他市售的钙离子荧光探针的区别是什么？有什么优势？以及探针的更新及发展历程等。感兴趣的朋友一起看看吧！

钙离子指示剂的发展历程

产品名称	研发时间	研发公司	产品特点	图示
Fluo-3	1987	Roger Tsien	第一款钙离子荧光探针	图1.各类荧光探针荧光强度对比图   图2.钙离子荧光探针在细胞内的工作原理
Fluo-4	1996	ThermoFisher	比Fluo-3的荧光更亮
Fluo-8	2008	AAT Bioquest	与Fluo-4相比： 1.拥有更亮的荧光 2.易于细胞加载
Cal-520	2014	AAT Bioquest	与Fluo-4相比： 1.拥有更长的细胞内保留时间 2.更高的信噪比
Calbryte-520	2017	AAT Bioquest	与其他产品相比： 1.它拥有亮的荧光 2.它拥有长的细胞内保留时间 3.更高的信噪比 4.更容易加载

Fluo-8

在Fluo-8的研发之前，Fluo-3、Fluo-4已广泛用于流式细胞术和酶标仪（如：FLIPR）上的钙离子检测，但是，弱荧光信号和苛刻的染料上样条件限制了它们在某些细胞分析中的应用。而Fluo-8的研发正好解决了Fluo-3和Fluo-4的这些局限性。

Fluo-3和Fluo-4在细胞应用中重要的性质是它们的吸收光谱与氩离子激光源488nm处的激发兼容，并且响应于Ca²⁺结合，荧光强度大大增强。我们的Fluo-8 钙离子检测试剂保留了这两个的特性。Fluo-8试剂的吸收和发射峰分别为490nm和514nm。在488nm的氩离子激光作用下，它们能得到很好的激发，其发射荧光（514nm）随Ca²⁺浓度的增加而增加。Fluo-8与Ca²⁺结合后荧光强度增加200倍以上。由于刺激后许多细胞内Ca²⁺的增加幅度通常是5-10倍，因此Fluo-8是Fluo-3和Fluo-4的替代品。Fluo-8的Kd估计为389nm（22°C，pH7.0–7.5），但该值可能受到pH、粘度和体内结合蛋白的影响。

表1.Fluo-8钙离子检测试剂的光谱和Ca²⁺结合特性

Fluo-8产品特点：

• 方便检测的波长:大激发490 nm；大发射514 nm。
• 荧光强度高：比Fluo-4 AM高2倍；比Fluo-3 AM高4倍。
• 更快的加载:在室温下（而不是Fluo-4 AM所需的37ºC）加载染料。
• 多功能Ca²⁺结合K_d如表1所示。

图3.将U2OS细胞以40000细胞/100ul/孔在96孔板中培养过夜。去掉生长培养基，将细胞分别与100ul的Fluo-3 AM、Fluo-4 AM和Fluo-8AM在HHBS中以4 uM的浓度在37°C、5%CO₂培养箱中培养1小时。用200ulHHBS洗涤细胞两次，然后使用FITC通道用荧光显微镜（Olympus IX71）成像。

Fluo-8相关产品：

Cal-520、Cal-590、Cal-630

Cal-520，Cal-590和Cal-630提供了强大的基于均相荧光的检测工具，用于检测细胞内钙动员。它们是荧光钙敏感染料，与现有的钙指示剂（如Fluo-3 AM，Fluo-4 AM和Rhod-2 AM）相比，具有明显的信噪比和细胞内滞留性。一旦进入细胞，Cal520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM的亲脂性基团就会被细胞内酯酶裂解，从而产生带负电荷的荧光染料，并留在细胞内部。与钙离子结合后，它们的荧光大大增强。当细胞被激动剂刺激时，该受体会发出细胞内钙释放的信号，从而增加Cal-520，Cal-590或Cal-630的荧光。 Cal-520 AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM的高灵敏度超过100倍的荧光增强特性使其成为测量细胞钙的理想指标。高信噪比和更好的细胞内保留能力使Cal-520，Cal-590或Cal-630钙测定成为评估GPCR和钙通道靶标以及筛选其激动剂和拮抗剂的强大工具。

表2.Cal-520，Cal-590或Cal-630 Ca²⁺检测试剂的光谱和Ca²⁺结合特性

图4.不含丙磺舒的CHO-M1细胞中内源性P2Y受体对ATP的反应。 将CHO-M1细胞以每100 µL 40,000个细胞的孔接种在黑色96孔板中过夜。 将HHBS中的100 µl 4 µM Fluo-3 AM，Fluo-4 AM或Cal520 AM加入孔中，并将细胞在37°C下孵育2小时。 将染料加载介质替换为100 µl HHBS，添加50 µl 300 µM ATP，然后使用FITC通道在荧光显微镜（Olympus IX71）上成像。

图5.用Cal-520或Fluo-4 AM测量的CHO-K1细胞中内源性P2Y受体的ATP刺激钙反应。 将CHO-K1细胞以每100 µL每孔50,000个细胞在黑色96孔板上接种过夜。 将100 µL 5 µM Fluo-4 AM和带有（A）或不带有（B）2.5 mM丙磺舒的Cal-520AM加入细胞中，并将细胞在37℃下孵育2小时。 通过FlexStation（分子设备）添加ATP（50 µL /孔）以达到终指示的浓度。

图6.CHO-K细胞中内源性P2Y受体对ATP的反应。 将CHO-K细胞以每100 µL 40,000个细胞的孔接种在黑色96孔板中过夜。 将含有1 mM丙磺舒的HHBS中的100 µl 4 µM Cal 590 AM或Cal 630 AM加到孔中，并将细胞在37°C下孵育2小时。 将染料上样介质替换为100 µl HHBS和1 mM丙磺舒，然后在添加50 µl 300 µM ATP之前和之后使用TRITC通道用荧光显微镜（Olympus IX71）成像。

Cal-520、Cal-590、Cal-630相关产品：

Calbryte 520、Calbryte 590、Calbryte 630

Calbryte 520，Calbryte 590和Calbryte 630为检测细胞内钙动员提供了强大的均相荧光分析工具。与现有的钙指示剂（例如Fluo-3 AM，Fluo-4 AM和Rhod-2 AM）相比，这些对钙敏感的染料明显更亮，并提供更高的信噪比，并大大了细胞内保留和负载效率。一旦进入细胞，Cal520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM的亲脂性阻断性AM基团就会被细胞内酯酶裂解，产生带负电荷的荧光Calbryte 染料，并留在细胞内。与钙结合后，它们的荧光大大增强。当细胞受到激动剂刺激时，该受体发出信号通知细胞内钙的释放，从而明显增加Calbryte 520，Calbryte 590或Calbryte 630的荧光。高灵敏度和大于100倍的荧光增强特性使Calbryte 520 AM， Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM是测量细胞内钙的强指示剂。

表3. Calbryte 520，Calbryte 590和Calbryte 630试剂的光谱和Ca²⁺结合特性。

图7. CHO-K1细胞中内源性P2Y受体对ATP的反应。 将CHO-K1细胞以每100 µL 40,000个细胞的孔接种在黑色96孔板中过夜。 将含有丙磺舒的HHBS中的100 µL Fluo-4 AM或Calbryte 520 AM加入孔中，并将细胞在37°C下孵育45分钟。 将染料加载介质替换为200 µL HHBS，添加50 µL 50 µM ATP，并使用FITC通道在荧光显微镜（Keyence）上成像。

图8.Calbryte 520或Fluo-4 AM测量的CHO-M1细胞中外源M1受体的卡巴胆碱刺激的钙反应。 将CHO-M1细胞以每100 µL每孔40,000个细胞的孔接种在黑色96孔板上。 将100 µL不含丙磺舒的Fluo-4 AM或Calbryte 520 AM加入细胞中，并将细胞在37℃下孵育45分钟。 FlexStation 3（分子设备）添加了卡巴胆碱（50 µL /孔）以达到终指示的浓度。

图9. CHO-K细胞中内源性P2Y受体对ATP的反应。 将CHO-K细胞以每100 µL 40,000个细胞的孔接种在黑色96孔板上。 将含有2 mM丙磺舒的HHBS中的100 µL Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM加入孔中，并将细胞在37°C下孵育1小时。 将染料加载介质替换为200 µL HHBS，用50 µL 50 µM ATP处理，并使用TRITC通道（Calbryte 590）和Texas Red Channel（Calbryte 630）用荧光显微镜（Keyence）成像。

Calbryte 520、Calbryte 590、Calbryte 630相关产品：

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