百萤问号：Western Blot实验中常见问题解答
English title: Western Blot FAQ
Published on 2020-07-13
Western 免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的实验。在WB 实验中常会出现各种问题，而拖慢实验速度，使实验达不到理想的效果。今天百萤跟各位同学一起分享下 WB 实验中各种问题及问题建议。
| 常见问题 | 可能原因 | 建议 |
| 电泳条带成笑脸状 | 胶不均匀冷切，中间冷却不好，电泳系统温度偏高 | 减少电压减慢电泳速度，在冷室或者冰浴中进行电泳 |
| 电泳条带成皱眉状 | 可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全 | 调整装置 |
| 拖尾 | 样品溶解不好 | 样品充分溶解混匀后上样 |
| 纹理(纵向条纹) | 样品中含有不溶性颗粒 | 样品充分搅拌混匀 |
| 条带偏斜 | 电极不平衡或者加样位置偏斜 | 调整电极和加样 |
| 条带两边扩散 | 加样量过多 | 适当减少上样量 |
| Marker 变黑色 | 抗体和 Marker 蛋白反应 | 在 Marker 和 sample 之间空出一个孔不上样 |
| 背景高 | 膜封闭不够 | 延长封闭时间，选择适宜的抗体稀释度 |
| 一抗稀释度不适宜 | 对抗体进行滴度测试，选择适宜的抗体稀释度 | |
| 一抗孵育的温度偏高 | 建议 4℃ 结合过夜 | |
| 二抗浓度度过高 | 降低二抗浓度 | |
| 二抗的非特异性背景 | 增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。可选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链） | |
| 二抗孵育时间过久 | 减少二抗孵育时间 | |
| 选择膜的问题 | 硝酸纤维素的背景会比 PVDF 膜低 | |
| 膜在实验过程中干过 | 实验过程中要注意保持膜的湿润 | |
| 检测时曝光时间过长 | 注意曝光时间的缩短 | |
| 洗膜不充分 | 增加洗膜的时间和次数 | |
| 抗体和封闭蛋白有交叉反应 | 检测抗体与封闭蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应 | |
| 杂带较多 | 目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点，糖基化位点，乙酰化位点等），本身可以呈现多条带 | 查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白试剂大小 |
| 目的蛋白有其他剪切本 | 查阅文献或生物信息学分析可能性 | |
| 样品处理过程中目的蛋白发生降解 | 裂解液中加入蛋白酶抑制剂，样品处理在冰上进行 | |
| 上样量过高，太敏感 | 适当减少上样量 | |
| 一抗不纯 | 纯化抗体 | |
| 一抗特异性不高 | 重新选择或制备高特异性的抗体 | |
| 二抗的非特异性结合 | 增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。可选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链） | |
| 一抗或二抗浓度偏高 | 降低抗体浓度 | |
| 细胞传代较多，导致蛋白变异 | 使用原代或传代少的细胞作对照 | |
| 蛋白条带位置 （大小）不对 |
二聚体或多聚体存在 | 增加蛋白质变性过程及强度 |
| 翻译后剪切 | 比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的，在执行功能时需要进行剪切成活化的形式 | |
| 相对电荷 | 氨基酸电荷的组成 | |
| 蛋白修饰 | 比如糖基化、磷酸化等修饰状态会导致蛋白分子量增加 | |
| 胶浓度 | 不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差 | |
| 无蛋白条带 | 抗体孵育不充分 | 增加抗体浓度，延长孵育时间 |
| 酶失活 | 直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物 | |
| 标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 | 设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因 | |
| 试剂之间不匹配 | 一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性 | |
| 一抗失效 | 选择在有效期内抗体，幷选择现配现用的工作液 | |
| HRP 抑制剂 | 所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠 | |
| 抗体不能识别测试种属的相关蛋白 | 购买抗体前应认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白 | |
| 二抗与一抗不匹配 | 选择针对一抗来源种属的抗体 | |
| 蛋白条带信号弱 | 抗体孵育不充分 | 增加抗体浓度，延长孵育时间 |
| 酶活性降低 | 直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物 | |
| 洗膜过度 | 洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用 0.1% 的弱去垢剂 Tween-20 | |
| 标本中靶蛋白含量太低 | 增加样本上样量 | |
| 抗体活性降低 | 选择有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置 | |
| 蛋白转移不充分 | 可以用丽春红染膜幷结合染胶（考马斯蓝）后确定条带是否转移到膜上或转移过度，适当调整转膜的时间和电流 | |
| 封闭过度 | 减少封闭剂的量或缩短时间，换用不同封闭剂类型 | |
| 曝光时间过短 | 延长曝光时间 | |
| HRP 抑制剂 | 所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠 | |
| 背景有黑色斑点 | 抗体与封闭试剂反应 | 使用前过滤封闭试剂 |
| HRP 偶联二抗中有聚集体 | 过滤二抗试剂，去除聚集体 | |
| 暗背景上白色带 | HRP 含量过高 | 降低酶联二抗的浓度 |
| 背景有不均匀的白色斑点 | 转膜过程中有气泡存在 | 仔细检测，避免存在气泡 |
| 抗体分布不均匀 | 孵育抗体时使用摇床 |
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