Amplite NADH 和 NADPH 检测试剂盒(比色法)

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产品优势  

1.无需酶参与即可特异性识别NADPH

2.在100μL反应体系中可检测低至3μM的NADPH

3.兼容96孔或384孔微孔板检测模式

 

适用范围

用于NADH 和 NADPH 检测

 

产品介绍

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）是细胞内两种关键的辅酶因子。其中，NADH是NAD+的还原形式，而NAD+通过腺苷核苷酸2'位羟基的酯化反应形成NADP。传统的NAD/NADH和NADP/NADPH检测方法依赖于340nm处NADH或NADPH吸光度的变化监测。由于紫外波段检测存在灵敏度低、干扰性强等固有缺陷，且NAD和NADH本身吸光能力较弱，传统方法往往需要大量样品，难以满足微量样本的检测需求。

AAT Bioquest品牌的Amplite NADH 和 NADPH 检测试剂盒提供了一种创新的解决方案。NADPH 探针是一种显色传感器，在 NADH 还原后，其最大吸光度约为 460 nm。在约 460 nm 处的吸光度增加与溶液中 NADPH 的浓度成正比。NADPH 探针可在无酶反应中识别 NADPH，并且吸光度微孔板读数仪可在约 460 nm 处轻松读取信号。

Amplite® 比色法 NADH 和 NADPH 检测试剂盒提供了一种灵敏的检测方法，可在 100 µL 检测体积中检测到低至 3 µM 的 NADPH。该检测可在便捷的 96 孔或 384 孔微孔板中进行。该技术突破了传统紫外检测法的局限，为研究人员提供了更可靠、更灵敏的检测方案。

 

适用仪器

96孔板检测示例

概述

准备NADPH反应混合物（50μL）

加入NADPH标准品或测试样品（50μL）

在室温孵育或15分钟至2小时

孵育460 nm处的监测吸光度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

 

操作步骤

1.准备NADPH原液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol / L）NADH储备溶液。

注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

 

2.准备NADPH反应混合物：

将1mL NADPH探针（组分A）加入4mL NADPH测定缓冲液（组分B）中，并充分混合。

注意：5mL NADPH反应混合物用于一个96孔。 未使用的NADPH反应混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

 

3.准备NADPH标准品的连续稀释液（0至100μM）：

3.1将100μLNADPH储备溶液（来自步骤1）加入400μLPBS缓冲液（pH 7.4）中，以产生200μM（100pmol / L）NADPH标准溶液。

注意：稀释的NADPH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL的200μMNADPH标准溶液进行1：2连续稀释，得到NADPH标准品的100,50,25,12.5,6.25,3.13和0μM连续稀释液。

如表1和2中所述，将NADPH标准品和含有NADPH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微量培养板中。

注意：根据需要制备细胞或组织样品。 为方便起见，裂解缓冲液（组分D）可用于裂解细胞（详见附录）。

 

表1在白色/透明底96孔微孔板中的NADPH标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS
NS1	NS1	...	...
NS2	NS2
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

注意：NS = NADPH标准，BL =空白对照，TS =测试样品

 

表2每个孔的试剂组成

NADPH	空白对照	测试样
连续稀释：50 ul	PBS:50 ul	50 ul

*注意：将连续稀释的NADPH标准品（3.13μM至200μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份

 

4.在上清液反应中运行NADPH测定：

4.1将50μLNADPH反应混合物（来自步骤2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NADPH测定体积为100μL/孔

注1：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADPH反应混合物。

注2：根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见，裂解缓冲液（组分D）可用于裂解细胞（详见附录）。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。

 

附录：使用组分D（裂解缓冲液）的测试样品制剂

1.植物细胞样品：用200mg / mL的裂解缓冲液均质化，并以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测试。

2.细胞样品：离心收集细胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液，将处理后的溶液在室温下保持15分钟.2500℃离心 转速5分钟，并用上清液进行试验。

3.哺乳动物细胞样品：从平板孔中取出培养基，每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液（或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔），并将处理过的溶液保持在室温下 15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟，使用上清液进行测试。

4.组织样品：称取约20mg组织，用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测定。