Cell Meter Beta-Arrestin蛋白质易位GPCR信号检测试剂盒

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适用范围

用于β-Arrestin蛋白质易位GPCR信号检测

产品介绍

几乎所有G蛋白偶联受体（GPCRs）在配体结合激活后，都会迅速通过共同通路发生脱敏。当胞质蛋白β-抑制素与激活的受体结合时，不仅能终止GPCR信号传导，还会启动受体向细胞内的转运过程——在此过程中配体被清除，受体则被循环利用并重返细胞膜。通过给β-抑制素添加绿色荧光蛋白（GFP）等荧光标记，即可实时监测受体-抑制素复合体的定位。由于脱敏现象仅发生于激活的受体，因此监测β-抑制素转位及随后的受体循环过程，就成为检测GPCR靶点激活的可靠方法。

Cell Meter™ β-Arrestin蛋白质易位GPCR信号检测试剂盒通过荧光成像技术，为筛选已知或孤立GPCR靶点的化合物活性提供了强大的功能性检测方案。当目标GPCR被激活时，会诱导荧光标记物向细胞膜/内吞小泡转位。

样品实验方案

概述

准备细胞进行转染
准备Transfectamine 5000-DNA混合物
将Transfectamine 5000-DNA混合物添加到细胞培养物中，并孵育过夜
转染后24-30小时将转染的细胞转移到96孔板中，并将培养物孵育过夜
在荧光显微镜下分析由GPCR引起的转运

细胞准备

细胞密度在转染时它们将达到约60-70％的融合度。
转染前用新鲜的生长培养基替换。
注意：例如，对于6孔板，每孔替换为2 mL培养基，对于10 cm板，则替换为6 mL培养基。

储备溶液配制

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。避免反复冻融。

β-arrestin-GFPDNA储备溶液
向小瓶β-arrestin-GFPDNA（组分A）中加入10 µL ddH2O，充分混合至终浓度为1 µg / µL。

操作步骤

1.将3 µg DNA（例如1.5 µg Beta-arrestin-GFP DNA储备液和1.5 µg您准备的GPCR DNA）与200 µL无血清培养基混合。

2.向混合物中加入9 µL Transfectamine 5000（组分B）。

3.充分混合并在室温下孵育20分钟。

注意：Transfectamine 5000和DNA的比例需要针对不同的细胞系进行优化，通常，在我们的测试中，Transfectamine 5000转染试剂（µL）与DNA（µg）的比例应为3-5 µL：1ug。

表1. 6孔板和10 cm板的样本表

转染和转运方案

1.将Transfectamine 5000 -DNA混合物添加到培养板中，并孵育过夜。

注意事项：在转染后16小时即可检测到重组蛋白。转染后72〜96小时可观察到大表达水平。

2.转染后24-30小时将转染的细胞转移到96孔板中，并孵育过夜。

使用FITC滤光片（Ex / Em = 488/530 nm）在荧光显微镜下检测受体诱导的β-arrestin易位。