荧光素-5-马来酰亚胺 CAS 75350-46-8

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产品介绍

马来酰亚胺是最常用的巯基修饰试剂之一。在大多数蛋白质中，其反应位点位于天然存在的半胱氨酸残基或由胱氨酸还原生成的半胱氨酸残基。与碘乙酰胺不同，马来酰亚胺在生理条件下不会与组氨酸和蛋氨酸发生反应。Fluorescein-5-maleimide与5-TMRIA同属蛋白质巯基修饰中最常用的荧光染料。

 

普通储备液制备

表 1. 将特定质量的荧光素 - 5 - 马来酰亚胺（Fluorescein-5-maleimide，CAS 号：75350-46-8）复溶至指定浓度所需的二甲基亚砜（DMSO）体积。

注：此体积仅用于储备液制备。有关合适的实验用 / 生理用缓冲液，请参考具体实验方案。

0.1 mg	0.5 mg	1 mg	5 mg	10 mg
1 mM	233.995 µL	1.17 mL	2.34 mL	11.7 mL	23.399 mL
5 mM	46.799 µL	233.995 µL	467.99 µL	2.34 mL	4.68 mL
10 mM	23.399 µL	116.997 µL	233.995 µL	1.17 mL	2.34 mL

 

 

储备液配制

除非另有说明，所有未使用的储备液应在配制后分装成单次使用量，并于-20°C保存。应避免反复冻融。

1.Fluorescein-5-maleimide储备液（Solution B）

向Fluorescein-5-maleimide瓶中加入无水DMSO，配制10 mM储备液，通过移液器吹打或涡旋充分混匀。

注：染料储备液（Solution B）需在偶联反应前新鲜配制并立即使用。延长储存时间可能导致染料活性降低。避光防潮条件下，Solution B可在冷冻环境中保存最多4周，应避免冻融循环。

2. 蛋白储备液（Solution A）

将100 µL反应缓冲液（如100 mM MES缓冲液，pH≈6.0）与900 µL目标蛋白溶液（如抗体，浓度建议＞2 mg/mL）混合，制备1 mL蛋白标记储备液。

注：蛋白溶液（Solution A）pH应维持在6.5±0.5；含牛血清白蛋白（BSA）或其他稳定蛋白的杂质抗体标记效果不佳；蛋白浓度低于2 mg/mL将显著降低偶联效率，推荐最终蛋白浓度为2-10 mg/mL。

3. 可选步骤

若目标蛋白不含游离半胱氨酸，需使用DTT或TCEP处理以生成巯基。DTT或TCEP可将二硫键还原为两个游离巯基。使用DTT后，必须通过透析或凝胶过滤去除游离DTT后才能进行染料马来酰亚胺偶联。以下为生成游离巯基的示例方案：

1.用蒸馏水新鲜配制1 M DTT溶液（15.4 mg/100 µL）

2.制备20 mM DTT的IgG溶液：每mL IgG溶液中加入20 µL DTT储备液，混匀后静置室温30分钟（避免混合以减少半胱氨酸重新氧化为胱氨酸）

3.将还原后的IgG过预平衡"交换缓冲液"的过滤柱，收集0.25 mL组分

4.通过分光光度法或比色法测定蛋白浓度，合并含主要IgG的组分

5.在此步骤后立即进行偶联反应（参见样品实验方案）。注：IgG溶液浓度应＞4 mg/mL以获得最佳效果；若低于2 mg/mL需进行浓缩；缓冲液交换柱损耗需额外增加10%用量；还原反应可在pH 7-7.5的多种缓冲液（如MES、磷酸盐或TRIS缓冲液）中进行；步骤3和4可用透析法替代。

 

样品实验方案

本标记方案针对Goat anti-mouse IgG与Fluorescein-5-maleimide的偶联物开发，实际应用时需根据特定蛋白进行优化。注：每种蛋白所需染料/蛋白比例不同，且受染料特性影响。过度标记会降低蛋白结合亲和力，而低标记比例会降低检测灵敏度。

 

进行偶联反应

1.以Solution B（染料）/Solution A（蛋白）10:1摩尔比为起始点：将5 µL染料储备液（Solution B，假定浓度为10 mM）加入蛋白溶液（95 µL Solution A）中，充分振荡混匀。假定蛋白浓度为10 mg/mL且分子量约200KD，则蛋白浓度约为0.05 mM。

注：推荐使用10:1摩尔比，若效果不佳可尝试5:1、15:1及20:1比例优化。

2.室温下继续旋转或振荡反应30-60分钟。

 

纯化偶联物

以下为使用Sephadex G-25柱纯化染料-蛋白偶联物的示例方案：

1.按制造商说明准备Sephadex G-25层析柱；

2.将反应混合物（来自"进行偶联反应"步骤）加至柱床顶端；

3.当样品液面略低于树脂表层时立即加入PBS（pH 7.2-7.4）；

4.继续加入PBS至目标样品完全洗脱，收集含目标染料-蛋白偶联物的组分。

注：立即使用时需用 staining buffer 稀释并分装；长期储存需浓缩或冻干处理。