iFluor 488琥珀酰亚胺酯

溶液配制

除非另有说明，所有未使用的储备液应在制备后分装，在 -20°C 下储存避免反复冻融

1.准备蛋白质储备溶液（溶液A）：

将100μL反应缓冲液（如1 M碳酸钠溶液或1 M磷酸盐缓冲液，pH~9.0）与900μL目标蛋白溶液（如抗体，蛋白质浓度> 2 mg / ml）混合至100μL，再加入1 mL蛋白质标记原液。

注1：蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0，则使用1M碳酸氢钠溶液或1M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH调节至8.0-9.0的范围。

注2：蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析，除去蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）。

注3：不纯的抗体、稳定的牛血清蛋白（BSA）抗体或明胶不会被很好的标记。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳汞，获得好的标记结果。

注4：如果蛋白质浓度低于2 mg / mL，标记效率会显着降低。为获得合适标记效率，建议蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。

2.准备染料储备溶液（溶液B）：

将无水DMSO加入到iFluor 488 SE小瓶中制备10mM储备溶液。 通过移液或涡旋混合均匀。

注意：在开始缀合前准备染料储备溶液（溶液B），立即使用。 染料储备溶液的长期储存会降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存两周，避光保存。 避免反复冻融。

样本实验方案

（本方案适用 Goat anti-mouse IgG 和iFluor 488 SE的共轭，每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能影响其结合亲和力，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。）

进行偶联反应：

1.使用10：1摩尔比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）作为起始点：将5μl染料储备溶液（溶液B，假设染料储备溶液为10 mM）加入到样品瓶中。蛋白质溶液（95μl溶液A）有效摇动。假设蛋白质浓度为10mg / mL，蛋白质的分子量为~200KD，蛋白质的浓度为~0.05mM。

注意：建议使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比为10:1。如果太少或太高，可以尝试5:1、15:1和20:1来确定合适的染料/蛋白质比。

2.在室温下继续旋转或摇动反应混合物30-60分钟

纯化偶联

（以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料蛋白偶联物的一个例子）

1.按照产品说明准备Sephadex G-25柱。

2.将“进行偶联反应”步骤中的反应混合物装入Sephadex G-25柱的顶部。

3.当样品刚低于顶部树脂表面时，立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。

4.向样品中加入更多的PBS（pH 7.2-7.4）完成柱子纯化。将含有目标染料-蛋白质缀合物的组分合并。

注意：如果需要立即使用，染料-蛋白质缀合物物需要用染色缓冲液稀释，并分装。

注意：为了长期储存，染料蛋白缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

图示

图1.将HeLa细胞与（Tubulin +）或（Tubulin-）小鼠抗微管蛋白一起孵育，然后与iFluor 488山羊抗小鼠IgG缀合物（绿色，左）和AlexaFluor®488山羊抗小鼠IgG缀合物（绿色）一起孵育，右）。细胞核用Hoechst 33342（蓝色）染色。

图2.人淋巴细胞上AlexaFluor®488和iFluor 488抗人CD4的流式细胞仪分析。在每个测试中，PBMC细胞都用0.5 ug 488抗人CD4和0.5 ug iFluor 488抗人CD4染色。在ACEA流式细胞仪系统上进行流式细胞仪分析。

图3. HeLa细胞先用兔抗微管蛋白染色，再用iFluor 488山羊抗兔IgG（H + L）染色，细胞核用nuclear red DCS1染色。

试剂应用文献