iFluor 488琥珀酰亚胺酯
Ex (nm) | 491 | Em (nm) | 516 |
分子量 | 945.07 | 溶剂 | DMSO |
存储条件 | 在零下15度以下保存, 避免光照 |
产品货期
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产品优势
1.高水溶性: 可以不用有机溶剂进行偶联,在储存期间不易沉淀;
2.出色的光稳定性:好的光稳定性可以实现更长时间的图像捕捉;
3.荧光亮度强:比其他光谱相似偶联物(例如 Alexa Fluor® 染料、荧光素染料、华菁染料等)的荧光更强;
4.pH值不敏感:在广泛的pH范围内具有很高的荧光强度;
适用范围
主要用于标记蛋白或抗体
产品介绍
AAT Bioquest生产的iFluor 488琥珀酰亚胺酯是一种明亮的绿色荧光染料。用于成像和流式细胞分析中稳定信号的生成。iFluor 488琥珀酰亚胺酯是与蛋白或抗体偶联的常用工具。NHS 酯可用于标记蛋白、胺修饰的寡核苷酸和其他含胺分子的伯胺 (R-NH2)。
溶液配制
除非另有说明,所有未使用的储备液应在制备后分装,在 -20°C 下储存避免反复冻融
1.准备蛋白质储备溶液(溶液A):
将100μL反应缓冲液(如1 M碳酸钠溶液或1 M磷酸盐缓冲液,pH~9.0)与900μL目标蛋白溶液(如抗体,蛋白质浓度> 2 mg / ml)混合至100μL,再加入1 mL蛋白质标记原液。
注1:蛋白质溶液(溶液A)的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0,则使用1M碳酸氢钠溶液或1M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH调节至8.0-9.0的范围。
注2:蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中,则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析,除去蛋白质沉淀的游离胺或铵盐(例如硫酸铵和乙酸铵)。
注3:不纯的抗体、稳定的牛血清蛋白(BSA)抗体或明胶不会被很好的标记。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳汞,获得好的标记结果。
注4:如果蛋白质浓度低于2 mg / mL,标记效率会显着降低。为获得合适标记效率,建议蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。
2.准备染料储备溶液(溶液B):
将无水DMSO加入到iFluor 488 SE小瓶中制备10mM储备溶液。 通过移液或涡旋混合均匀。
注意:在开始缀合前准备染料储备溶液(溶液B),立即使用。 染料储备溶液的长期储存会降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存两周,避光保存。 避免反复冻融。
样本实验方案
(本方案适用 Goat anti-mouse IgG 和iFluor 488 SE的共轭,每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例,这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能影响其结合亲和力,而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。)
进行偶联反应:
1.使用10:1摩尔比的溶液B(染料)/溶液A(蛋白质)作为起始点:将5μl染料储备溶液(溶液B,假设染料储备溶液为10 mM)加入到样品瓶中。蛋白质溶液(95μl溶液A)有效摇动。假设蛋白质浓度为10mg / mL,蛋白质的分子量为~200KD,蛋白质的浓度为~0.05mM。
注意:建议使用溶液B(染料)/溶液A(蛋白质)的摩尔比为10:1。如果太少或太高,可以尝试5:1、15:1和20:1来确定合适的染料/蛋白质比。
2.在室温下继续旋转或摇动反应混合物30-60分钟
纯化偶联
(以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料蛋白偶联物的一个例子)
1.按照产品说明准备Sephadex G-25柱。
2.将“进行偶联反应”步骤中的反应混合物装入Sephadex G-25柱的顶部。
3.当样品刚低于顶部树脂表面时,立即加入PBS(pH 7.2-7.4)。
4.向样品中加入更多的PBS(pH 7.2-7.4)完成柱子纯化。将含有目标染料-蛋白质缀合物的组分合并。
注意:如果需要立即使用,染料-蛋白质缀合物物需要用染色缓冲液稀释,并分装。
注意:为了长期储存,染料蛋白缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。
图示
图1.将HeLa细胞与(Tubulin +)或(Tubulin-)小鼠抗微管蛋白一起孵育,然后与iFluor 488山羊抗小鼠IgG缀合物(绿色,左)和AlexaFluor®488山羊抗小鼠IgG缀合物(绿色)一起孵育,右)。细胞核用Hoechst 33342(蓝色)染色。 |
图2.人淋巴细胞上AlexaFluor®488和iFluor 488抗人CD4的流式细胞仪分析。在每个测试中,PBMC细胞都用0.5 ug 488抗人CD4和0.5 ug iFluor 488抗人CD4染色。在ACEA流式细胞仪系统上进行流式细胞仪分析。 |
图3. HeLa细胞先用兔抗微管蛋白染色,再用iFluor 488山羊抗兔IgG(H + L)染色,细胞核用nuclear red DCS1染色。 |
试剂应用文献
Authors: Rocher, Caroline and Vernale, Am{\'e}lie and Fierro-Consta{\'\i}n, Laura and S{\'e}journ{\'e}, Nina and Chenesseau, Sandrine and Marschal, Christian and Issartel, Julien and Le Goff, Emilie and Stroebel, David and Jouvion, Julie and others,
Journal: (2024)
Authors: Gnatyuk, Olena and Kolesnyk, Denys and Voitsitskyi, Taras and Karakhim, Sergiy and Nikolenko, Andriy and Dementjev, Andrej and Solyanik, Galina and Dovbeshko, Galyna
Journal: Spectroscopy Journal (2024): 306--321
Authors: Gnatyuk, Olena Petrivna and Kolesnyk, Denys Leonidovych and Voitsitskyi, Taras and Karakhim, Sergiy Olexandrovych and Nikolenko, Andrii and Dementjev, Andrej S and Solyanik, Galina Ivanivna and Dovbeshko, Galina Ivanivna
Journal: (2024)
Authors: Filep, S and Reid Black, K and Smith, B and Bermingham, M and Pomes, A and Chapman, M
Journal: Clinical Chemistry (2024): hvae106--429
Authors: Sidhu, N and Maksymowych, WP and Wichuk, S and Marotta, A
Journal: Clinical Chemistry (2024): hvae106--427