Screen Quest 荧光法葡萄糖摄取检测试剂盒
| Ex (nm) | - | Em (nm) | - |
| 分子量 | - | 溶剂 | - |
| 存储条件 | 在零下15度以下保存, 避免光照 |
产品货期
咨询
产品介绍
葡萄糖转运系统负责将葡萄糖转运穿过细胞膜。测量组织或细胞中葡萄糖类似物2-脱氧葡萄糖（2-DG）的摄取量，被广泛认为是评估葡萄糖摄取量、研究葡萄糖代谢调控及胰岛素抵抗机制的一种可靠方法。2-DG的摄取通常使用氚或C14标记的非代谢型2-DG进行测定。然而，常规使用放射性标记探针成本高昂，且需要繁琐的特殊处理步骤。
AAT Bioquest的Screen Quest™ 荧光法葡萄糖摄取检测试剂盒提供了一种灵敏且非放射性的细胞检测方法。在该检测中，2-DG被葡萄糖转运蛋白摄取，并代谢为2-DG-6-磷酸（2-DG6P）。不可代谢的2-DG6P在细胞内积累，其积累量与细胞的葡萄糖摄取量成正比。积累的2-DG6P经酶促氧化生成NADPH，并通过荧光NADPH传感器进行特异性监测。信号可通过荧光酶标仪读取。
适用仪器
| 荧光酶标仪 | |
| 激发： | 540nm |
| 发射： | 590nm |
| cutoff: | 570nm |
| 推荐孔板： | 黑色孔板 |
样品实验方案
简要概述
1.接种细胞，并根据需要对细胞进行处理
2.每孔加入 10 µL 2-DG，在 37°C 下孵育 20-40 分钟
3.洗涤细胞并裂解细胞
4.每孔加入 50 µL 2-DG 摄取检测工作溶液
5.在室温下孵育 30 至 120 分钟
6.在激发/发射波长 = 540/590 nm 处监测荧光增强
重要说明
开始实验前，请在室温下解冻所有试剂盒组分。上述方案适用于一块 96 孔板。
除非另有说明，所有未使用的储备液应在配制后分装成单次使用份，并储存于 -20°C。避免反复冻融。
KRPH 缓冲液储备液 (1X)：
将 20 mL KRPH 缓冲液 (5X) (组分 H) 加入 80 mL 去离子水中，充分混匀。
注： 50 mL 体积的 1× KRPH 缓冲液大约足够用于一块 96 孔板。按比例配制所需体积。将未使用的 1× KRPH 缓冲液储存于 4°C 或 -20°C。
工作溶液的配制
NADP 工作溶液：
向 NADP (组分 G) 的小瓶中加入 100 µL 水，充分混匀。
酶探针工作溶液：
将 5 mL 检测缓冲液 (组分 F) 加入酶探针 (组分 E) 的瓶中，充分混匀。
2-DG 摄取检测工作溶液：
将 100 µL NADP 工作溶液加入酶探针工作溶液中，充分混匀。
注： 这些量适用于一块 96 孔板。
样品实验方案
重要说明：本方案可作为培养 3T3-L1 脂肪细胞进行 2-DG 摄取的指南。
1. 在实验前 4-6 小时，将细胞接种于生长培养基中，96 孔板为 50,000-80,000 个细胞/孔/100 µL，384 孔黑色壁/透明底多聚-D-赖氨酸细胞培养板为 12,500-20,000 个细胞/孔/25 µL。
2.从培养箱中取出细胞板，吸去孔内培养基，每孔加入 100 µL（96 孔板）或 25 µL（384 孔板）无血清培养基进行饥饿处理。将细胞置于 37°C、5% CO₂ 培养箱中培养 6 小时至过夜。
3.从培养箱中取出细胞板，吸去孔内培养基，用 100 µL/孔的 1× KRPH 缓冲液轻轻洗涤细胞两次。
4. 每孔加入 90 µL 葡萄糖摄取缓冲液（组分 B），将细胞置于 37°C、5% CO₂ 培养箱中孵育 1 小时。
5.用或不含胰岛素或待测化合物刺激 20 分钟。每孔加入 10 µL 10× 胰岛素溶液（终浓度 1 µM）或 10× 待测化合物溶液。同时，向未处理孔中加入 10 µL 胰岛素溶剂缓冲液或化合物溶剂缓冲液作为对照，置于 37°C、5% CO₂ 培养箱中孵育 20 分钟。
葡萄糖摄取抑制研究（可选）： 加入 10× 根皮素（终浓度 200 µM）或待测抑制剂，在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 2-5 分钟。
注： 建议向胰岛素处理组和未处理组（作为对照）均加入 10 mL 抑制剂溶剂缓冲液。根皮素处理的细胞可用作阳性对照。
6.每孔加入 10 µL 2-DG 溶液（组分 A），在 37°C、5% CO₂ 培养箱中孵育 20-40 分钟。对于阴性对照，留出一些孔不进行胰岛素、抑制剂和 2-DG 处理。
7.处理后，吸去每孔溶液，用 KRPH 缓冲液（100 µL/孔）轻轻洗涤细胞 3 次，以去除溶液中多余的 2-DG。吸去孔内的 KRPH 缓冲液。
8.每孔加入 25 µL 酸性裂解缓冲液（组分 C），在 37°C 下孵育 20 分钟以裂解细胞。同时可准备 2-DG 摄取检测混合液。
9.每孔加入 25 µL 中和缓冲液（组分 D），充分混匀，室温放置 5-10 分钟以中和细胞裂解液。
10.向 2DG6P 标准品（未提供）或细胞裂解液的每孔中加入 50 µL 2-DG 摄取检测工作溶液。
11.室温下避光孵育反应 30 分钟至 2 小时。
12.使用荧光酶标仪在激发/发射波长 = 530-570/590-600 nm（最佳激发/发射 = 540/590 nm，截止波长 570 nm）处监测荧光增强。
试剂应用文献
